α和β地中海贫血无创产前诊断研究进展

α和β地中海贫血无创产前诊断研究进展

    地中海贫血是我国长江以南各省(区)发病率最高的一种单基因遗传病，主要类型是α和β地中海贫血，分别是由于α或β珠蛋白基因发生缺失或点突变，使其编码的人α或β珠蛋白链缺如或不足，导致严重的溶血性贫血[1]。目前地中海贫血主要靠输血和去铁治疗维持，也可采用骨髓移植治疗手段，但代价均十分昂贵。通过产前诊断选择性流产受累胎儿是世界上公认的首选对策。因此，针对高风险地中海贫血胎儿的产前诊断是实现人群预防和控制的重要手段。近40年来，随着DNA分析技术的不断发展，各种快速、简便的产前诊断方法被应用于地中海贫血的产前诊断[2-3]。然而，传统获取胎儿遗传物质进行的产前诊断为有创性操作，即通过穿刺手术采集绒毛、羊水或脐带血，可能造成胎儿损伤、流产或宫内感染等风险。1997年Lo等[4]研究发现妊娠母体血浆中存在胎)LDNA，基于此类胎儿遗传物质的产前诊断更安全，且易于被受试者接受，也避免了获取胎儿遗传物质的创伤性操作导致的不必要风险。

1 母体血液中的胎儿遗传物质

    妊娠妇女血循环中的胎儿遗传物质以两种形式存在，一种是完整的胎儿细胞，另一种是胎儿游离DNA(cff-DNA)[4]。母体血液中胎儿细胞含量极少，在妊娠3个月时仅1～2个细胞／ml[5]。而cff-DNA含量相对较多，出现的时候也较早。L0等[6]的研究结果显示，在相同的妊娠期，母体血浆中的cff-DNA含量是胎儿细胞成份的20多倍，妊娠5周就能从母体血液中检测到cff-DNA，妊娠11周即占母体血浆总DNA的0.39％，并随妊娠时间的延长而增加，妊娠晚期可达6.2％。cff-DNA主要以小片段形式存在，99％为小于313 bp的片段[7-8]。cff-DNA在母体血液中的半衰期很短，仅16 min左右，产后2 h在母体内迅速消失，提示cff-DNA可作为产前诊断的重要靶标，为开展无创产前诊断(non—invasive prenatal diagnosis，NIPD)提供了新的检测材料。同时，由于母体血液中胎儿细胞的研究受制于其技术的复杂性和可靠性，尚未成为无创产前诊断的主流技术。

2 基于母体cff-DNA的无创产前基因诊断

    自从发现了母体血浆中存在IIJLDNA，以此胎儿遗传物质为基础的NIPD技术临床应用发展迅速[9-10]。最先应用的对象是检测cff—DNA中性别决定基因(SRY)和Rhesus D(RhD)基因。21世纪初即有报道通过检测母体外周血中的SRY和RhD基因判断胎儿性别以排除x连锁遗传病，或为Rh阴性妊娠妇女的胎儿处置提供诊断依据[11]。此外，还能从母体游离DNA中检测父源性突变基因，判断胎儿来自父系的遗传性状，对于常染色体隐性遗传病来说，这一方法可使那些仅遗传了父亲野生型等位基因的胎儿免于创伤性产前基因诊断[12]。

    由于从母体血液中分离富集胎儿细胞操作方法繁琐费时，且稳定性欠缺，故基于cff-DNA的NIPD方法逐渐成为该领域的主流技术。基于母体血浆中胎儿DNA的无创产前基因诊断需要有足够的用于检测的胎儿遗传物质，以及适用于妊娠早期分析的高敏感度的检测方法。然而，由于cff-DNA片段短、含量低，应用于单基因病的无创产前诊断面临着许多技术挑战：①检测方法必须具备足够的敏感度从高母源性DNA背景下检测低拷贝胎儿DNA。②母源性DNA分子的基因突变与胎儿突变相同时，无法直接鉴定胎儿的基因型。③母体外周血中的短片段胎儿DNA不利于采用聚合酶链反应(PCR)扩增技术检测缺失突变。为应对这些技术难题的可行性诊断策略仍在不断的探索中[13-15]。其中最引人注目的进展是采用二代测序技术已经可以实现胎儿全基因组范同的无创突变分析[ 14]，且能够在检测胎儿全基因组的基础上对胎儿的遗传性和新发突变进行鉴定[15]。这些新方法有望成为包括单基因病在内的遗传病无创检测临床应用的重要技术基础。与此同时，近几年对母体血浆中游离DNA的定量检测技术取得了重要进展，基于母体外周血cff-DNA的二代测序技术，可通过对基因组范围的目标序列的精确定量分析，进行染色体非整倍体的无创产前检测。2011年以来，已开展了针对常见的21、18和13三体的无创产前检测的临床应用[16-17] 。基于cff-DNA的二代测序技术的发展为单基因病无创产前基因诊断的l临床应用提供了重要技术支撑。此外，母体血液中cff—DNA量的增加还可作为多种妊娠相关疾病(如子痫、早产等)的临床诊断指标，这也是未来值得关注的产科保健技术发展的新领域。

    地中海贫血的无创产前诊断领域可参考文后文献[18]。2002年，Chiu等[19]采用等位基因特异性荧光PCR为夫妻双方均为不同β地中海贫血基因突变者进行产前诊断，在不携带β地中海贫血CD41／42(-CTTT)突变的妊娠妇女血浆中，定性检测胎儿中的父源性这一突变基因的存在状况，从而通过排除父源I生突变来判断检测对象是否为受累胎儿。针对基因突变类型相同的双亲，则采用基于单核苷酸多态性(SNP)单倍型的连锁分析方法检测胎儿的基因型，通过连锁信息间接诊断父源性突变等位基因是否遗传给了胎儿，2004年[20]、2005年[21]、2010[22]年及2011年[23]的研究报道，即为此方案分别应用于β地中海贫血点突变及α地中海贫血常见缺失类型的无创产前诊断。这些方法可使那些未遗传父源突变基因的胎儿免于创伤性胎儿取样，但仍然不能在母胎基因突变相同的情况下对胎儿的基因型进行准确诊断。

3 地中海贫血无创产前诊断的突变分析策略

    地中海贫血无创产前诊断的突变分析主要包括以下3种策略。

3.1  双亲携带异型突变的排除法诊断策略  如图1所示，当双亲的突变基因型不同，如夫妇双方分别为β地中海贫血CD41/42和CD17突变类型时，只要在母体血液中未检测到CD41/42突变基因，则提示胎儿未遗传父源突变基因，其基因型只有野生纯合及CD17突变杂合2种可能，而无需进行穿刺取样确诊胎儿β地中海贫血基因型。此策略相对简单，采用等位基因特异性PCR等常规定性方法即能实现，Chiu等[19]、Galbiati等[24]和Li等[25]报道的β地中海贫血无创产前诊断所采用的即为这一策略。

3.2  双亲携带同型突变的排除法诊断策略  如图2所示，当双亲的突变基因型相同，如夫妻双方均为β地中海贫血CD41/42突变携带者，无论胎儿是何基因型，母体血液中均有CD41/42突变基因。这种情况下，先筛选夫妇双方有差异、与父源突变基因连锁的SNP标签，通过检测母体血浆中是否存在父源连锁的SNP而判断胎儿是否遗传了父源突变基因。此方案首先必须筛选和确定一组人群特异性标签SNP，在应用时将标签SNP在夫妇间进行分析，检测确定两者存在区别的阳性SNP靶点，用于产前诊断。Ding等[20]报道的β地中海贫血即为这一策略。Yan等[23]进一步发展了用于检测仪地中海贫血大片段缺失的类似方法，其设计要点是在缺失区内必须先筛选和确定一组对应于正常等位基因的人群特异性标签SNP，该方法进行了大样本应用评价，并对此策略进行了详细的描述。

3.3  基于SNP或单倍型的相对定量诊断策略 如图3所示，双亲在突变杂合子相同的情况下，直接采用可进行精细定量的数字PCR技术，针对含突变位点的区域分别进行正常和突变等位基因的短片段PCR扩增(可针对每个突变位点设计不同PCR扩增片段)，对母体血浆总游离DNA中的含SNP目的序列进行定量检测，再通过数据统计及生物信息学分析计算出突变与野生型等位基因的相对含量。若胎儿为突变杂合子，母体血浆中的胎儿游离DNA中，突变型与野生型等位基因的剂量是相等的，母体自身的基因组DNA中的比例亦是如此，所以母体血浆总DNA中的突变与野生单倍型的相对量相等。若胎儿为突变纯合子，那么进入母体血浆的胎儿游离DNA中只含有突变单倍型，因此，母体血浆总DNA中的突变单倍型多于野生型；反之，若胎儿为野生纯合子，母体血浆总DNA中的野生单倍型多于突变单倍型。很显然，设计一套针对不同突变的数字PCR体系，即可用于解决双亲在任何突变杂合子相同情况下的β地中海贫血诊断问题[26]。由于每个不同突变是独立的检测体系，无论夫妇双方的突变类型是否相同，胎儿的上述3种基因型均可通过数字PCR的定量得以确定。当然，在双亲携带异型突变，且母方突变遗传给胎儿时，cff-DNA中与母方相同的突变为“杂合子”剂量，遗传自父方的那种不同的突变通过定性检测即可给出结果。在上述思路基础上，最新发展的基于单倍型的相对定量诊断策略是一种采用二代测序结合数字PCR技术的更为通用的分析方法，其设计方案中增加了两个变化：一个是采用二代测序技术对目标区域进行捕获，并一次性同时完成所需序列信息的采集，不需设计针对不同突变区域多个检测单元；另一个是通过数字PCR技术，采用上述相同原理分析目标区域内由一组SNP构成的单倍型的剂量，并据此确定双亲单倍型和cff—DNA中的单倍型的信息，从而判断出胎儿的基因型[27-28]。

4 地中海贫血无创产前诊断的展望

    无创产前诊断对胎儿无损伤、且可于妊娠早期检测，是产前诊断临床应用领域的重要发展方向。用于检测的胎儿遗传物质中，cff—DNA仍然是毫无争议的主角。就技术而言，高通量、高敏感性、高准确性、自动化和标准化是方法学研究的目标与方向，二代测序技术以其独特的技术优势将成为主流技术平台。然而，如何将这些方案与策略付诸临床实践，以及新技术的优化和稳定仍需艰苦努力，需进一步经过方法学的创新探索和不断完善才能发展出适宜临床、可满足我国人群单基因病筛查需要的二代测序技术。未来几年，在地中海贫血无创产前诊断领域，有望实施临床应用评价研究和规范化的临床应用。

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