应用母血中胎儿游离DNA进行无创产前诊断的研究进展
目前孕期对胎儿染色体进行检测的方法包括有创性和无创性两大类,有创性检查主要是通过早、中、晚孕期采集胎儿标本经过体外培养对染色体进行核型分析,是诊断染色体异常的金标准,但是培养周期长,有培养失败的可能,且有发生流产、死胎、感染等风险[l],部分孕妇存在心理负担;无创性检查主要包括产前筛查和近些年发展起来的胎儿染色体非整倍体无创基因检测(non—invasive fetal trisomy,NIFTY)[2],前者通过对母亲体内血清标志物的分析间接对胎儿进行风险评估,而后者是通过对母血中胎儿游离DNA(cell free fetal DNA,cffDNA)进行直接分析,对胎儿染色体病诊断起到辅助作用,其流程简便,且无流产、感染等风险,易于为孕妇接受,是产前诊断未来的发展方向。
1 cffDNA的来源
1997年Dennis Lo[3]发现母体血浆中存在胎儿游离DNA,从妊娠第5周开始即可通过定量PCR的方法检测,随着孕周的增加母体中游离DNA浓度相应增加[4-5],分娩后2小时即检测不到cffDNA,其半衰期为4—30min[5],因此本次妊娠不会受到既往妊娠的影响。
对于cffDNA的来源,一般认为有以下3种可能:(1)进入母体循环的胎儿细胞。胎儿细胞进入母体循环后发生凋亡,从而释放出cffDNA[6]。(2)胎盘滋养层细胞凋亡后释放DNA至母体循环中,有研究发现在胎盘循环建立后80% 的孕妇血浆中可以检测到胎儿DNA[7] 。(3)胎儿DNA直接跨膜转运。羊水中存在大量胎儿细胞凋亡后释放的DNA,其浓度远远高于母体循环中胎儿DNA的浓度,这种浓度梯度促使DNA分子通过胎盘和膜发生跨膜转运。
2 通过c竹DNA进行胎儿非整倍体检测
研究发现,母体血浆中的胎儿游离DNA片段大小在193~313 bp之间,而母体的DNA片段多在1 000 bp左右[8]。有学者利用琼脂糖凝胶电泳收集母血中胎儿DNA,但是效率低下且易受母体DNA污染;也有学者针对母胎之间甲基化程度不同位点、胎儿特有的SNP位点进行量化分析,从而对胎儿非整倍体进行诊断。后来Lo等通过对cffDNA测序绘制出胎儿全基因组图谱,表明cffDNA涵盖了胎儿的全部基因组信息[9]。
2008年,有学者应用大规模并行基因组测序技术(massively parallel genomic sequencing,MPGS)检测cffDNA[10]。MPGS具有所需样本量较少、高通量、检出率高、无创性等优点。母体血浆样品中存在母源性和胎源性DNA分子,通常母体均为正常二倍体,所以母血浆样品中DNA分子的微小改变只能是由胎儿非整倍体导致。应用MPGS对母体血浆样本中cffDNA进行测序检测,通过对cffDNA微量变化的捕捉,来判断2l号染色体的cffDNA是否增加,从而诊断胎儿是否为21 三体[11]。白2011年投入临床,全世界已完成超过3万例的检测,其敏感性和特异性均超过99%[12],是一项比母体血清学筛查准确许多而接近于诊断的产前非整倍体检测技术。研究表明,如果早孕期联合筛查结果为高风险,通过cffDNA检测结果为阳性者,胎儿为21 三体的几率为7/8[13]。
当该方法应用于检测18 三体和13 三体时,敏感性却大大降低 ,原因是13号、18号染色体靶位点的GC含量分别为38.5%和39.8% ,而21号染色体的GC含量是40.9% ,高于或低于41%的GC含量会影响测序的覆盖率,进而影响其准确性[15-16]。
3 通过cffDNA进行单基因疾病检测
由于母体血浆中母源DNA远远多于cffDNA,很难摆脱母源DNA的影响,所以目前主要诊断对父系等位基因进行检测,如RhD阳性胎儿、父系致病等位基因、Y染色体测序等[171~有学者应用MPGS对45 392个SNPs位点进行检测,得到大于90%的SNP位点信息,通过相对变异剂量(relative mutation dosage,RMD)方法获得胎儿基因型信息 ,此法已应用于β一地中海贫血、镰状细胞性贫血和血友病的非侵入性检测[19-20]。
总之,无创伤性产前诊断在临床上有着广泛的应用前景,高通量、自动化、低成本、高准确性的MPGS技术显著
促进了无创产前诊断的发展,对cffDNA的理化性质,富集提取及其实验方法的研究必将进一步推动无创伤性产前诊断在临床的应用。
参考文献
[1] 边旭明,戚庆炜.染色体异常产前筛查和产前诊断工作任重而道远[J].中国实用妇科与产科杂志,201 0,26(1 2):889-890.
[2] 吴清明,周瑾.出生缺陷产前筛查及产前诊断研究进展[J].中国优生与遗传杂志,2011,19(1):129—131.
[3] Lo YM,Corbetta N,Chamberlain PF,et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J].Lancet,1997,350(9076):485-487.
[4] Devaney SA,Palomaki GE,Scott JA,et al.Noninvasive fetal sex determination using cell-free fetal DNA:a systematic review and meta—analysis[J].J Am Med Assoc.,2011,306(6):627—636.
[5] Lo YM,Zhang J,Leung TN,et al.Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma[J].Am J Hum Genet.,1999,64(1):218—224.
[6]Chim SSC,Tong YK,Chiu R WK,et a1.Detection of the placental epigenetic signature of the m aspin gene in maternal plasma[J].Proc Nat Acad Sci USA,2005,1 02(41):14753—14758.
[7]Alberry MS,Maddocks DG,Jones M,et al.Free fetal DNA in maternal plasma in anembryonic pregnancies:confirmation that the origin is the trophoblast[J].Prenat Diagn.,2007,27(5):41 5—41 8.
[8]Chan KC,Zhang J,Hui AB,et al.Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma[J].Clin Chem.,2004,50(1):88—92.
[9]Lo YM,Chart KC,Sun H,et al.Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome—wide genetic and mutational profile of the fetus[J].Sci Trans Med.,201 0,2(61):61-91.
[10]Chiu RW ,Chan KC,Gao Y,et al.Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,1 05(51 1:20458-20463.
[11]Sehnert AJ,Rhees B, Com stock D,et al.Optimal detection of fetal chromosomal abnormalities by massively parallel DNA sequencing of cell— free fetal DNA from maternal blood[J].Clin Chem.,201 1,57(7):1042-1049.
[12]Chiu RW ,Lo YM. Noninvasion prenatal diagnosis empowered by high—throughput sequencing[J].Prenat Diagn.,201 2,32(4):401—406.
[13]Palomaki GE,Deciu C ,Kloza EM ,et al.DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 1 8 and trisomy 1 3 as well as Down syndrome:arl international collaborative study[J].Genet Med.,2012,14(3):296—305.
[14]Chen EZ,Chiu RW ,Sun H,et al.Noninvasive prenatal diagnosis of fetal trisomy 1 8 and trisomy 1 3 by maternal plasma DNA sequencing[J].PLoS One,2011.,6(7):e21791.
[15]Jiang F,Ren J,Chen F,et al.Noninvasive Fetal Trisomy(NlFTY)test:an advanced noninvasive prenatal diagnodsis methodology for fetal autosomal and sex chromosomal aneuploidies[J].BMC Med Genomics,201 2,5(1):57.
[16]Fan HC,Quake SR.Sensitivity of noninvasive prenatal detection of fetal aneuploidy 什0m maternal plasma using shotgun sequencing is limited only by counting statistics[J].PLoS One,2010,5(5):e10439.
[1 7] Fan HC,Gu W,Wang J,et al.Non—invasive prenatal measurement of the fetal genome[J].Nature,2012,(487):320—324.
[1 8] Lam KW,Jiang P,Liao GJ,et al Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by targeted massively parallel sequencing of maternal plasma:application to[beta]一thalassemia[J].Clin Chem.,201 2,58(1O):1467—1475.
[1 9] Barrett AN,McDonnell TC,Chan KC,et al.Digital PCR analysis of maternal plasma for noninvasive detection of sickle cell anemia[J].Clin Chem.,201 2,58(6):1 026—1032.
[20] Tsui NB,Kadir RA,Chan KC,et al.Noninvasive prenatal diagnosis of hemophilia by microfluidics digital PCR analysis of maternal plasmaDNA[J].Blood,2011,117(13):3684—3691
互联网药品信息服务资格证 (京)-经营性-2010-0046
产科网 Copyright © 2010www.obstetrics.cn. All Rights Reserved 京ICP备15060573号-14
产科网所刊载之内容仅用于学术交流目的。您从产科网上获取的信息不得直接用于诊断、治疗疾病及您的健康问题。
本站所有文章版权归原作者所有,转载仅为传播信息促进医学事业发展,如果我们的行为侵犯了您的权益,请及时与我们联系,我们将妥善处理该部分内容。