无创产前基因检测技术的临床应用价值评价

作者：赵晓曦|谷孝月单位：内蒙古医科大学附属医院妇产科来源：中华诊断学电子杂志编者：

中华诊断学电子杂志 2015-4-2 阅读字号：T|T

无创产前基因检测技术的临床应用价值评价

目前临床上对胎儿染色体非整倍体的检测方法，主要包括早中孕的母体血清筛查实验、超声检查和侵入性产前诊断技术（包括羊水穿刺，绒毛活检和脐静脉血穿刺），通过这些技术可使９０．００％以上的胎儿非整倍体在产前得到诊断^{［１~２］}。但以上技术都存在各自的缺点，母体血清筛查实验是通过分析孕妇血清中胎儿和胎盘产生的蛋白和激素水平结合孕妇的年龄、体质量和孕周评估胎儿患２１—三体，１８—三体以及神经管缺陷的风险性，这种方法的特点是廉价简单，但其准确性低，假阳性率高；而侵入性产前诊断技术准确性高，但技术难度大，同时还存在可能引起流产和感染等并发症，因此不适合对大规模孕妇进行检查。１９９７年首次发现在孕妇血浆中存在游离的胎儿ＤＮＡ，此后探索利用母血中胎儿游离ＤＮＡ进行产前筛查和诊断成为这一领域研究热点^［３^］。无创产前基因检测技术，是基于以上研究诞生的一种新的产前胎儿染色体非整倍体检测技术，其原理是扩增孕妇血中游离胎儿ＤＮＡ片段，采用高通量测序技术对其进行测序、计数，并通过生物信息技术处理，来判断胎儿是否存在染色体异常^［４］。本研究通过分析７４例无创产前基因检测报告，探讨这一技术在临床中的应用价值。

对象与方法

一、研究对象

选取２０１１年６月至２０１４年１月在内蒙古医科大学附属医院妇产科，因具有进行产前诊断临床指征就诊的７５例孕妇，其年龄在２１～４５岁，孕周１２～３２周。分组：（１）高龄妊娠组（≥３５岁）；（２）母体血清筛查显示高危组；（３）超声显示胎儿异常组；（４）生育过２１三体患儿组。所有患者均签署知情同意书。

二、研究方法

１．无创基因检测方法：（１）采用ＥＤＴＡ抗凝管，抽取孕妇外周血５ｍＬ。４℃条件下以１５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，离心机半径１７ｃｍ，取上清平均分装到离心管中；（２）将收集血浆，采用ＦｌｅｘｉＧｅｎｅＤＮＡｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ公司，美国）试剂盒提取ＤＮＡ；（３）将获得的游离ＤＮＡ经过末端补平、加“Ａ”、加接头、ＰＣＲ富集，最终获得对应样本的ＤＮＡ文库；（４）用Ａｎｇｌｅｎｔ２１００以及Ｑ—ＰＣＲ仪对文库质量进行检测。将检测合格后的若干文库根据质量１∶１的比例进行混合建库（即Ｐｏｏｌｉｎｇ）；（５）将获得的Ｐｏｏｌｉｎｇ文库，经Ｃｂｏｔ桥式反应扩增，最后送ＨｉＳｅｑ上机测序，获得原始数据直接传送到大型机；（６）每一测序ｒｅａｄｓ染色体定位通过比对到Ｅｎｓｅｍｂｌｅ数据库的人类基因组参考序列来确定。统计出能够匹配到参考序列唯一位置的２１，１８，１３号及性染色体上序列数目，然后计算每一母体血浆样本中２１，１８，１３号及性染色体序列数目与总的序列数目的比值。通过计算测试样本的待测染色体的比例与总体人群的比率之差，除以对照组中待测染色体的方差，所得值成为Ｚ值，若Ｚ≥３，即认为待测样本为三体高危；反之Ｚ≤－３，则为单体高危。

２．羊水染色体核型分析方法：在超声引导下，行羊膜腔穿刺术，抽取羊水２０ｍＬ，离心，取０．５ｍＬ沉淀，混匀后加入有羊水培养基的瓶内，静置于３７．０℃、５．００％二氧化碳的培养箱进行开放式培养，经５～７ｄ更换培养液后再培养１～２ｄ，此时向培养瓶内加入一定量的秋水仙素，使羊水细胞分裂停止在其分裂中期，再经３７．０℃低渗后，固定、制片、显带、染色处理，即得到用于染色体核型分析的羊水细胞标本片。

３．随访：对无创产前基因检测显示低危的孕妇，在胎儿出生后对其进行医学检查，判定胎儿是否存在染色体异常。

结果

在７５例无创产前基因检测标本中，７４例获得检测结果，１例患者２次采血均未获得足够量的胎儿ＤＮＡ，而放弃检查，检测成功率为９８．７０％。在有结果的７４例患者中，发现１１例染色体非整倍体高危患者，高危患者比率１４．９０％。见表１。

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对１１例无创产前基因检测显示高危患者行胎儿羊水细胞染色体检查，最终确定异常核型９例，在高危患者中异常核型的比率为８１．８０％。在这１１例患者中共有７例常染色体非整倍体高危患者和４例性染色体高危患者，在７例常染色体高危患者中６例与染色体核型结果一致，一致性８５．７０％（６／７）；在性染色体的高危患者中一致性７５．００％（３／４）。１例无创产前基因检测显示２１—三体高风险患者，羊水细胞染色体核型分析显示４６，ＸＹ。另１例无创产前基因检测显示４个Ｘ染色体的患者，最终羊水细胞染色体核型分析为４６，ＸＸ，见表２。

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在７４例患者中，到目前为止已经出生胎儿５５例，在已经出生的５５例新生儿中，在出生时体检和出生后４０ｄ随访中，未发现染色体非整倍体异常患儿。１例患者无创产前基因检测结果显示正常，但在孕２８周时，Ｂ超显示胎儿足内翻，发育迟缓，脐带血穿刺检查胎儿染色体，胎儿染色体核型４６，ＸＹ，ｄｅｒ（１０），ｔ（６；１０）／４７，ＸＸＹ，ｄｅｒ（１０），ｔ（６；１０）。

讨论

本研究结果显示，无创产前ＤＮＡ检测是一种有效的筛查胎儿染色体非整倍体的方法，但在目前条件下它仅能作为一种筛查胎儿染色体病的手段。胎儿染色体是否存在异常，最终要由侵入性产前诊断确诊。目前，临床上广泛应用的筛查唐氏综合征的方法是母体血清筛查实验，５个近年产前血清筛查研究报告中，共包含４９４５５人份的血清筛查结果，筛查出的高风险人群占总人群的６．１０％，在高危人群中有９３．２０％的人接受了侵入性产前诊断，最后确诊为染色体异常的患者为１４１例，占总高危人群的５．００％。在高危人群中确诊为唐氏综合征比率为２．７０％，假阳性率９９．７０％，假阴性率０．０３％^［５］。无创产前基因检查与目前临床上所用的母体血清筛查实验相比，具有准确率高，假阳性率低的特点。本研究对１１例无创产前基因筛查高危患者进行羊水细胞染色体核型分析，无创产前基因检查结果与染色体核型分析结果一致率可达到８１．８０％。虽然本研究范围较小，但足以显示无创产前基因检测在筛查胎儿染色体非整倍体中的应用价值。本研究是在有临床产前诊断指征的患者中实施的，而对一般孕妇来说，这一检测方法同样是一种有效手段。Ｓｏｎｇ等^［６］对４００万例一般孕妇的无创产前基因检测结果进行分析，其中５３３０例无创产前筛查显示高危孕妇进行了侵入性产前诊断，最后确诊为２１—三体的患者为４８２３例；检测率为９０．４８％。

临床上最常见的胎儿染色体异常是２１—三体、１８—三体、１３—三体和胎儿的性染色体异常，１８—三体和１３—三体患儿通常存在多发畸形，在超声检查时易被发现^［７］。而２１—三体和性染色体非整倍体通常较难被超声发现，目前临床上对性染色体异常的筛查缺乏有效手段。而本研究的结果显示无创产前基因检测对性染色体异常同样有一定筛查作用，准确率可达到７５．００％。在本研究中，有２例孕妇的检测结果显示假阳性，这可能与限定性胎盘嵌合体有关。在性染色体显示高危时，还有可能母亲本身染色体存在异常。本研究中２例假阳性患者未做进一步检查，因此无法确定造成假阳性的原因。在本研究中，同样有１例假阴性的结果，这例患者同时存在染色体结构和数目异常，造成假阴性的原因可能与异常细胞系的比例较低有关。

综上所述，无创产前ＤＮＡ检测技术的临床应用，可以显著的减少侵入性产前诊断在临床上的应用，提高侵入性产前诊断阳性检出率。

参考文献

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