孕妇血循环中胎儿DNA以两种形式存在,一是存在于进入母体血循环中的胎儿的完整细胞内,二是游离于母体血浆中。分析孕妇外周血循环中完整胎儿细胞DNA或游离 DNA,是无创性产前诊断领域的一个日益引人注目的技术, 这一技术可以单独使用或与其他无创性检查方法,如超声诊断、孕妇血清学分析等联合应用,使无创性产前诊断技术提高到一个新的水平。近年采用先进的磁珠细胞分选法 (magnetic cell sorting, MACS)、流式细胞分选术和激光捕获 显微分离(laser capture micro dissection , LCM)技术富集分离胎儿细胞,发现孕妇血中存在较丰富的胎儿游离DNA,只要利用足够敏感的方法,就能对胎儿性连锁疾病和其他一些遗传性疾病进行无创早期诊断。本文就母血中胎儿DNA的存在形式、分析方法以及临床应用的进展情况综述如下。
一、孕妇血循环中胎儿完整细胞的检测
早在19世纪末,就有人在孕妇肺循环中发现胎儿滋养层细胞,此后人们一直希望通过分析母体血液循环中胎儿的细胞成分来进行无创产前诊断,但真正实施起来却并非易事。主要困难在于母血中胎儿细胞数量极少,且与母体细胞混合不易分离。通过大规模研究,目前已知进入母体的胎儿细胞有滋养层细胞、淋巴细胞、粒细胞、有核红细胞等,胎儿细胞与母体有核细胞的比例约为(1~2)1: 06 ,估计每毫升母血中仅有1~2个完整胎儿细胞,20~30ml血样,才能获得 1~3个胎儿细胞,其中大多数在处理过程中丢失[1,2]。因 此,必须进行有效富集和分离,才能用于诊断性研究。20世纪80年代,美国和德国分别建立了荧光激活细胞分选(fluorescent activated cell sorting ,FACS)及MACS技术,使得 利用母血循环中胎儿细胞进行产前诊断成为可能。由于胎儿淋巴细胞存活期较长,为避免上次妊娠残留的胎儿细胞干扰结果,研究者多选择胎儿有核红细胞作为研究对象。与母血中其他类型的胎儿细胞相比,有核红细胞生存期短(大约 90d),数量较多,而且高密度表达多种抗原,便于富集和识 别。尽管如此,利用母血中胎儿完整细胞进行产前诊断,还是操作繁琐、技术难度很大的方法,其大致步骤是先对血样进行密度梯度分离,再用MACS或FACS技术对胎儿细胞进行分选。MACS技术多用于结合在细胞表面的抗体检测,如抗2CD71(转铁蛋白受体)或抗血型糖蛋白A(GPA)识别胎儿细胞[3],而FACS技术则多用于细胞内蛋白结合的抗体如抗 HbF[4]。对富集得到的少量胎儿细胞,须用敏感的染色体荧 光原位杂交(FISH)或PCR技术检测其遗传学异常表现。一些最新的细胞分离技术,如LCM技术也被试用于胎儿细胞的分离[1]。LCM技术,是将靶细胞通过红外脉冲共价固定在塑料薄膜上,将膜转移至PCR反应管帽中,并在膜上将细胞裂解,通过离心使细胞裂解物进入PCR反应管,在其中进行分析。目前,利用孕早期和孕中期母血中完整胎儿细胞进行非整倍体诊断的敏感性接近75%,假阳性率为0.6%~ 4.1%[2] 。检测失败的原因可能是母血中胎儿细胞数量太少, 胎儿细胞缺乏特异性标志,富集方法尚不够充分有效。总的来说,孕母血中有极少量的完整胎儿细胞存在,但分离和鉴定程序复杂,费用昂贵,敏感性低,不宜用作临床诊断[5]。
二、孕妇血浆中游离胎儿DNA的存在
孕妇血循环中胎儿DNA的发现,对无创性产前诊断方法的改进产生了巨大影响。相对于完整细胞而言,孕妇血浆中游离胎儿DNA就丰富多了,妊娠11~17周,胎儿游离 DNA含量占母血浆DNA总含量的3.4%(0.39%~11.9%),在晚期妊娠可达6.2%(2.33%~11.4%)。研究 发现,妊娠第5周就可以检测出,并且随孕周数增加而升高,从而成为产前诊断的很好的物质基础[6,7]。孕妇血中游离胎儿DNA来源尚未阐明,目前认为存在两种机制:其一,进入母体的胎儿细胞受到母体免疫系统攻击而发生溶解,DNA释放入母血循环中[8];其二,胎儿发育过程中存在与发育相关的细胞凋亡,释放出的DNA经母体2胎儿界面进入母血循环中[9]。
为区别血浆中孕妇自身的DNA序列,常常需要Y染色体上的序列作为胎儿DNA的标志,性别决定基因(sex determine region of Y chromosome ,SRY)是最常用的标志基 因。使用实时定量PCR方法检测70例妊娠男胎的孕妇,全部检出SRY基因,4例妊娠女胎的孕妇全部阴性,方法的敏 感性和特异性均达到100.0%[10,11],证明母体血浆中胎儿SRY 的扩增技术已经足够成熟,可以快速有效的用于早期鉴定胎儿性别。
为考察既往妊娠对检测结果的影响,研究者[10]检测了 27例曾经至少一次孕育过男胎,而现妊娠女胎的孕妇,无一例SRY阳性,说明既往妊娠对现行检测结果无干扰。深入研究发现,母血中胎儿DNA的清除半衰期约为16.3min,分娩2h后,孕妇血浆中胎儿DNA已经检测不到[12,13],据此可以排除既往妊娠残留在母体内的胎儿DNA对当前妊娠所造成的假阳性诊断的可能性。
三、胎儿游离DNA的检测方法
虽然孕妇血中胎儿游离DNA较胎儿完整细胞含量丰富,但其绝对量仍然极其微少,需要非常敏感的方法才能获得稳定可靠的检测结果。PCR技术的发展使微量的胎儿 DNA不再是限制产前基因诊断的因素。近年报道的用于产 前基因诊断的PCR技术,有套式PCR法、引物延伸预扩增 (PEP)-PCR法以及实时荧光定量(QF)-PCR法,等等。
1.套式PCR法:套式PCR的原理是针对某一个待检 基因,设计二对特异性引物,其中一对巢居于另一对引物的扩增产物内部。先用外侧引物进行PCR扩增,获得一定量的产物后再用第二对引物进行扩增。由于进行了二次扩增,使PCR反应的敏感性和特异性都得到提高。国内学者从孕妇血浆及血清中提取DNA,用套式PCR对SRY基因进行两次扩增。结果发现,18份孕男胎的孕妇血浆DNA经第一次扩增,有12例出现SRY条带,其余6例在第二次扩增后出现阳性扩增条带,敏感性分别为72.2%,100.0%;而血清 DNA提取物第一次扩增后有9个出现SRY条带,第二次扩 增后17个阳性扩增条带,检出率分别为50.0%,94.4%。将孕妇外周血经密度梯度离心后,用显微操作技术分离单个有核红细胞,用套式PCR扩增SRY,敏感性为8010%,特异性为87.5%;扩增血浆游离DNA的SRY片段,敏感性为 89.1%,特异性为94.7%[14]。
2.PEP-PCR:Zhang等[15]首先建立了对单个细胞DNA 进行全基因组扩增的PEP-PCR法。该法用随机的15聚寡核苷酸引物扩增单个细胞的DNA,使之增加30~1000倍,以供进一步PCR分析。采用这种方法,先行对标本中总 DNA进行扩增,以增加目的基因拷贝数,能够解决因孕妇外 周血中胎儿DNA量太少而达不到常规扩增条件所要求的最低模板量的问题,可提高PCR的敏感性。贺桂芳等[16]利用该法扩增SRY基因最低模板量为0.0005pg,而直接用套式 PCR扩增所需的最低模板量为0.05pg,敏感性提高100倍。 对65例孕妇外周血血浆中SRY基因进行PEP-PCR检测,男胎的符合率为89.13%(41/46),女胎的符合率为94.97% (18/19)。PEP-PCR后再用微孔板探针杂交法检测扩增产 物,男胎的符合率提高到95.63%(44/46),女胎符合率为 100%。
3.QF2PCR是目前国内外临床实验室推荐使用的基因 诊断方法。该方法将特异引物扩增和探针杂交相结合,进一步提高了实验的敏感性和特异性。PCR反应过程中,可根据荧光强度的变化,对待测基因进行实时定量。定量结果描述为基因组当量/ml(genome-equivalents/ml),1个基因组当量定义为存在于1个男性二倍体细胞中特定DNA序列的量[17]。QF-PCR的整个反应过程以及结果的定量测定都在密闭的仪器中自动完成,防止由于污染造成的假阳性。为开展大规模无创性产前遗传学筛查, 2003年又报告了采用母血干纸片检测胎儿DNA[18],大大方便了标本的采集和运送。方法是在含有6~7滴孕妇手指血滴的滤纸片上,取6个3mm直径的血纸片(含血液112μl)用于提取DNA,作为 QF-PCR的模板。QF-PCR可在同一反应管中同时检测胎儿 多个基因位点,如SRY和RhD[19];而且能够定量检测游离胎儿DNA和总DNA,借此可以识别不同妊娠状态,如子痫前期和早产[20],将无创性产前基因诊断水平提升到新的高度。
四、临床应用
为了获得胎儿组织以便进行产前诊断,临床上常需创伤性操作,如羊膜腔穿刺、绒毛膜活检等。这些操作带来的危险有时会超过待检出的胎儿异常。如羊膜腔穿刺可致母体抗RhD抗体滴度升高,使胎儿患溶血性疾病的危险性加大。无创性超声检查结合血清学分析在筛查胎儿染色体异常方面取得了很大进展,但是不能检出胎儿单基因异常。在人类基因组计划顺利实施,人们对遗传基因的了解越来越详尽的今天,这一缺陷愈显突出。利用胎儿细胞或游离DNA,可以进行单基因遗传病的诊断[21]。由于母血中胎儿游离DNA存在于母体DNA的强大背景中,所以应用游离胎儿DNA进行产前诊断也受到一定限制,目前主要用于检测常染色体显性遗传病和来自父系的遗传性状,如胎儿性别(诊断X-连锁疾病),RhD状态[6,19],软骨病[21]和强直性肌营养不良[22]等。2002年,Poonl等[23]利用后生性标志,如胎儿与母体 DNA甲基化的差异来区分两者,冲破了上述限制。用甲基 化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)方法,不仅能检测父系来源的等位基因,也能检测母系来源的等位基因。
1.性连锁疾病与非整倍体妊娠的产前诊断:已知的性 连锁疾病大约有150多种,为了及早诊断这些疾病,必要时终止妊娠,需要早期快速鉴定胎儿性别[19,24]。
2.为遗传性疾病提供产前治疗依据:检测母体血循环 中胎儿DNA在其他一些染色体疾病的发现上也有重要应用,如瞳孔发育不良和先天性肾上腺肥大(CAH)[ 25,26] 等, 结合胎儿性别鉴定,可为产前治疗提供依据。CAH是肾上腺21-羟酶基因(CRP21P)缺陷性疾病。由于21-羟酶缺陷引起体内雄性激素分泌过多,导致女性胎儿的男性化。通过产前地塞米松治疗能够阻止受影响的女胎男性化,而此治疗对男性胎儿无任何临床意义。因此,正确进行胎儿CAH的产前诊断和性别鉴定对治疗十分重要。研究发现,如果在母体血浆中发现有来源于父系的野生型CRP21P等位基因,可以排除胎儿患有CAH;同时利用QF-PCR方法正确检出母体血浆中的SRY基因,则可以避免对未患CAH的女性胎儿或患有CAH的男性胎儿进行非必需的地塞米松治疗。
3.病理妊娠的产前诊断:在病理妊娠状态下,孕妇血浆 胎儿DNA水平异常升高,一是由于病理妊娠胎盘组织局部坏死或细胞凋亡[27]而释放大量胎儿DNA进入母血循环,二是由于负责清除血循环中DNA的主要器官,如肝、肾等功能受损而清除减少。Leung等[28]发现,早产孕妇血浆中胎儿DNA要比相同孕期正常孕妇高2倍,且胎儿DNA在真性早产和假性早产的孕妇血浆中的水平也存在着差异,这种差异可以用来鉴别真、假早产。另一种病理妊娠是先兆子痫,研究发现,胎儿DNA在先兆子痫孕妇血清中的含量要比正常孕妇高5倍[17],在子痫发作之前孕妇血浆中的胎儿DNA水平即有异常升高[20]。这些研究结果表明,孕妇血浆(清)中的胎儿DNA水平的测定不仅可以诊断先兆子痫,而且还有预测子痫的发生的作用。
总之,母血中胎儿基因检测在产前基因诊断中有着明显的优势。采用孕妇血液作为检测材料,对胎儿没有创伤性,可在孕早期做出诊断。克服了传统产前诊断技术在取材以及检测时间等方面的缺陷和限制。可用于鉴定胎儿性别和 Rh血型,进行性连锁疾病与非整倍体妊娠的产前诊断及病理妊娠的产前诊断,并可为一些遗传性疾病的产前治疗提供依据。
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