背景:目前认为,子痫前期与胎盘局部缺血、缺氧,并分泌可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)和可溶性内皮糖蛋白(sENG-1)入母体血循环相关。sFlt-1和sENG-1分泌入血后会造成广泛的血管内皮功能紊乱,临床表现为高血压和多系统器官损伤。近期研究表明,缺氧诱导因子1a(HIF-1a)的小分子拮抗剂,可有效减少sFlt-1和sENG-1的分泌,但尚不明确其是否会对妊娠有影响。二甲双胍在孕期可安全使用,并可通过降低线粒体电子传递链的活性来拮抗HIF-1a。
目的:探明(1)二甲双胍对于sFlt-1和sENG-1分泌的影响;(2)二甲双胍对sFlt-1和sENG-1分泌的影响是否是通过调控线粒体电子传递链完成;(3)二甲双胍对于血管内皮功能紊乱、母体血管舒张功能和血管生成的影响。
研究设计:利用原代人体组织进行功能性实验,测试二甲双胍对于胎盘、内皮细胞、胎盘绒毛组织分泌sFlt-1和sENG-1的影响。利用琥珀酸盐、线粒体复合物Ⅱ受体基质,测试二甲双胍是否通过调控线粒体电子传递链来影响sFlt-1和sENG-1的分泌。从子痫前期且早产孕妇胎盘标本中分离出线粒体,分为实验组和对照组,并利用动力学光度法测量线粒体电子传递链的活性。
利用二甲双胍孵育血管内皮细胞或母体全血管,以研究血管内皮功能紊乱是由肿瘤坏死因子a(TNF-a)引起的,或仅是使用了胎盘条件培养基后引起的。还测试了二甲双胍对孕妇网膜血管组织血管生成的影响。
结果:二甲双胍可以减少原代内皮细胞、绒毛细胞滋养层细胞、早产的子痫前期胎盘绒毛组织中sFlt-1和sENG-1的分泌。若孵育琥珀酸盐,sFlt-1和sENG-1的分泌量会减少,这说明二甲双胍对sFlt-1和sENG-1分泌量的调控很可能是在线粒体水平完成的。另外,使用线粒体电子传递链阻滞剂鱼藤酮和抗霉素会减少sFlt-1的分泌,这进一步说明了sFlt-1的分泌是通过线粒体调节。与对照组相比,子痫前期且早产孕妇胎盘的线粒体电子传递链活性增强。
二甲双胍可以改善与子痫前期相关的内皮功能紊乱。同时可降低血管内皮细胞血管细胞黏附分子-1(VCAM1)的mRNA的表达,VCAM1由TNF-a诱导产生,是一种炎症粘附因子,在与子痫前期相关的内皮功能紊乱发生时分泌增加.若使用胎盘条件培养基培养,会破坏又缓激肽介导的血管舒张效应,而二甲双胍可拮抗这一影响。二甲双胍同时可以改善由sENG-1介导的全血管生成障碍。
总结:二甲双胍可以减少原代人体组织中sFlt-1和sENG-1的分泌,可能是通过抑制线粒体电子传递链完成。在子痫前期且早产孕妇胎盘中,线粒体电子传递链的活性将增强。二甲双胍可抑制血管内皮功能紊乱,促进网膜动脉血管舒张,并加速血管生成。二甲双胍可能具有预防和治疗子痫前期的潜能。
正文:
子痫前期是一种严重的妊娠并发症,每天全球范围内有超过100名孕产妇和400名围产儿死于该疾病。子痫前期病理生理过程中的重要一步是胎盘局部缺血、缺氧,从而分泌可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)和可溶性内皮糖蛋白(sENG-1)入母体血循环。sFlt-1和sENG-1的分泌入血会造成广泛的血管内皮功能紊乱,造成多器官系统损伤。目前并无有效疗法可阻止该疾病的进展,期待疗法和分娩仍旧是唯一的治疗选择。如果存在一种在妊娠期可安全使用的药物,既可以减少胎盘sFlt-1和sENG-1的分泌,又可以改善血管内皮功能紊乱,该药物则可能对治疗和预防子痫前期有效。
利用缺氧诱导因子1a(H1F1a)抑制剂治疗子痫前期已经引起了人们的广泛关注。胎盘缺血缺氧时H1F1a分泌量增加,并协同促进sFlt-1的分泌。故H1F1a拮抗剂可以降低sFlt-1的分泌。H1F1a拮抗剂YC-1和G毒毛旋花苷已经表现出可抑制胎盘sFlt-1的分泌。但是,YC-1和G毒毛旋花苷在妊娠期使用的安全性尚未可知,它们在临床中多用于治疗肺间质增生和癌症。
以上研究提示需寻找一种可在孕期安全使用的H1F1a抑制剂——二甲双胍。二甲双胍是一种传统的口服降低高血糖的药物,先已被用于治疗妊娠期糖尿病。近期有研究表明,二甲双胍可用于阻止乳腺癌和前列腺癌的扩散,并延长寿命。这一发现引起了人们对二甲双胍深层药理机制的关注,也有研究发现二甲双胍可以通过抑制线粒体电子传递链中的复合体Ⅰ来抑制H1F1a。故提出假设:二甲双胍可能会降低患子痫前期妇女sFlt-1的分泌。
此前有报道称二甲双胍具有血管升压素活性,流行病学研究也表明二甲双胍可以有效降低多囊卵巢综合征或糖尿病患者的心血管并发症死亡率。这均由于二甲双胍可有效降低血管官腔细胞中的VCAM-1水平,而血管腔内的VCAM-1在炎症或子痫前期状态下会增多。已有研究发现二甲双胍会刺激糖尿病鼠血管舒张素的分泌。
实验材料和方法:
实验材料:将二甲双胍作用于人体组织进行功能性试验,评估其对sFlt-1和sENG-1分泌量、线粒体电子传递链、血管内皮功能紊乱的影响。分别使用了胎盘组织和血管组织。
实验选择了多种类型胎盘组织。从足月孕妇胎盘和脐带中收集并分离出人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和原代绒毛细胞滋养层细胞。从早发型子痫前期重度蛋白尿孕妇胎盘中收集胎盘绒毛组织,这些胎盘均来自小于34周剖宫产分娩手术后,疾病诊断标准遵照ACOG临床指南。多实验室合作,从胎盘组织中4个随机部位取出标本进行活检。所有取胎盘活检的孕妇均同时具有高血压和蛋白尿症状,蛋白尿诊断标准是24小时尿中蛋白大于300mg。胎盘绒毛组织详细准备如前所述。
为了评估线粒体电子传递链活性,选择23名早产且患有早发型子痫前期重度蛋白尿孕妇作为实验组,25名早产且正常血压孕妇作为对照组,对照组孕妇不患有绒毛膜羊膜炎或其他妊娠合并症。所有诊断为子痫前期的孕妇均存在蛋白尿。所有胎盘均来自剖宫产分娩后。线粒体电子传递链活性研究详细如前所述。
收集择期剖宫产孕妇网膜组织,如前所述分离网膜动脉,将其用于评估二甲双胍对于血管舒张和血管生成的影响。利用压力肌动描记法评估血管舒张功能,利用网膜动脉组织分析法评估血管生成功能。
体外实验评估二甲双胍、线粒体电子传递链活性、sFlt-1和sENG-1底物和抑制剂、血管内皮功能紊乱
HUVECs密度为24000个细胞每平方厘米,处于第2-4代之间,37℃,20℅O2中培养24小时。原代绒毛膜滋养层细胞密度为24000个细胞每平方厘米,孵育过夜以保证有足够多的细胞贴壁,清洗掉凋亡单核合胞体滋养层片段后培养24小时直到密度为50000个细胞每平方厘米,37℃,8℅O2中培养48小时,以评估sFlt-1和sENG-1的分泌情况。大约取20mg每个容器的胎盘绒毛组织37℃,8℅O2中培养72个小时。
分别在HUVECs、原代绒毛膜滋养层细胞、胎盘绒毛组织中加入0、1、2、5mmol/L的二甲双胍,HUVECs、原代绒毛膜滋养层细胞中加入0、0.5、1mmol/L二甲双胍和25mmol/L原代绒毛膜滋养层细胞也被用于加入线粒体电子传递链抑制剂鱼藤酮,浓度分别为0、 0.625、1.25、2.5、5 umol/L,以及另外的抑制剂抗霉素A,浓度分别为 0、 0.156、 0.31、 0.63 、1.25 umol/L。
诱导内皮功能步骤:(1)使用10ng/ml持续剂量的TNF-a孵育HUVEs;(2)利用25%条件性胎盘绒毛组织培养基培养网膜动脉;(3)网膜动脉中加入250ng/ml的sFlt-1,37℃,20%O2。同时在0、1、2、5mmol/L的HUVEs和0、5mmol/L的网膜动脉中加入二甲双胍,培养3小时。在1mmol/L的网膜动脉中加入二甲双胍,培养120小时。
sFlt-1、sENG、VCAM-1、sFlt-1、e15a、i13的测量
选用胎盘条件培养基培养组织和细胞。选用RNeasy mini试剂盒提取RNA进行功能试验,并做HUVECs血管内皮功能紊乱试验。选用DuoSetVEGF R1/Flt-1试剂盒和DuoSetHuman Endoglin CD/105 ELISA试剂盒进行sFlt-1 和sENG酶联免疫试验。选用NanodropND 1000 分光光度计定量测试RNA。选用Applied Biosystems的高容量cDNA逆转录酶工具包将RNA逆转录为互补DNA。选用Sybr基因表达分析法,分析sFlt-1 e15a和sFlt-1 i13,选用taqman基因表达分析法,分析VCAM-1。
评估二甲双胍对于系膜动脉血管扩张的影响
利用网膜动脉组织评估二甲双胍对于血管生成功能的影响
选用calcein AM试剂盒对网膜动脉组织着色,在40×EVOS FL 显微镜下拍照,并从照片中得出结果。
结果:
二甲双胍有效减少原代内皮细胞和胎盘组织sFlt-1的分泌
由于sFlt-1主要由内皮和胎盘组织分泌,故评估二甲双胍对于其影响。无论是HUVECs来源的内皮细胞,还是原代绒毛膜滋养层细胞,向其中加入剂量依赖性二甲双胍,均会降低sFlt-1的分泌。加入最高剂量二甲双胍,会分别减少53%内皮细胞和63%原代细胞中sFlt-1的分泌。二甲双胍同时能减少胎盘绒毛组织中sFlt-1的分泌,这些胎盘绒毛组织来自4位诊断为子痫前期且小于34周早产的孕妇。
此外,同时研究了二甲双胍对于相关细胞或是胎盘绒毛组织中不同sFlt-1变异体mRNA的表达的影响。sFlt-1 i13是内皮细胞中含量最丰富的sFlt-1变异体。剂量依赖性二甲双胍会减少内皮细胞sFlt-1 i13mRNA的表达。sFlt-1 e15a是人类胎盘组织中主要的变异体,二甲双胍可以减少原代绒毛膜细胞滋养层细胞和胎盘绒毛组织的sFlt-1 e15a的mRNA的表达,这些组织均来自诊断为子痫前期且早产的孕妇。因此可得出结论:二甲双胍可以降低sFlt-1各种亚型的表达,也可降低内皮细胞/组织或是胎盘细胞/组织sFlt-1的分泌。
二甲双胍有效减少原代内皮和胎盘组织sENG的分泌
经过研究二甲双胍对于原代内皮细胞和胎盘细胞/组织sENG分泌的影响发现:剂量依赖性二甲双胍会有效减少HUVECs和原代绒毛膜滋养层细胞的sENG的分泌。在三倍计量时,二甲双胍对胎盘绒毛组织sENG的分泌有降低趋势,但这种趋势并不明显。这些胎盘绒毛组织来自诊断为子痫前期且早产的孕妇。
二甲双胍通过抑制线粒体电子传递链而减少sFlt-1和sENG的分泌
二甲双胍通过阻滞复合体Ⅰ活性而抑制线粒体电子传递链活性,从而研究sFlt-1分泌的减少是否是通过阻滞线粒体电子传递链完成的。琥珀酸盐是线粒体复合体Ⅱ的主要组成成分,是二甲双胍阻滞的下游。也就是说,如果二甲双胍通过阻滞复合体Ⅰ活性而减少sFlt-1的分泌,那么琥珀酸盐就会积蓄电子流并消除这一影响。所以,琥珀酸盐可以消除由内皮细胞和原代绒毛膜滋养层细胞诱导的sFlt-1的分泌的减少;琥珀酸盐同时亦可以消除由HUVECs和原代绒毛膜滋养层细胞的sENG的分泌的减少。这些数据表明:二甲双胍以线粒体为媒介减少sFlt-1和sENG的分泌。
通过阻滞线粒体电子传递链而减少原代绒毛膜滋养层细胞sFlt-1的分泌
目前,线粒体可调控sFlt-1分泌的这一观点还很新颖。为了得到更多的证据,将研究其他的线粒体电子传递链阻滞剂是否能减少sFlt-1的分泌。选用线粒体复合物Ⅰ阻滞剂鱼藤酮,可以减少原代绒毛膜滋养层细胞65%的sFlt-1的分泌。选用线粒体复合物Ⅲ阻滞剂抗霉素,可以减少75%的sFlt-1的分泌。鱼藤酮和抗霉素计量均不会致细胞死亡。以上研究为线粒体参与调控sFlt-1的分泌提供了更多证据。
在子痫前期且早产胎盘中线粒体电子传递链活性会增强
由于线粒体表现出可影响sFlt-1和sENG-1的分泌,故作出假设子痫前期胎盘可增强线粒体电子传递链活性。23例子痫前期且早产的胎盘为实验组,25例血压正常且早产的胎盘为对照组,比较二者间线粒体电子传递链的活性的差异。得出结论:子痫前期且早产的胎盘线粒体电子传递链中4个复合体均活性增强,其中复合体Ⅱ活性增强最为明显。所以,在子痫前期且早产胎盘中线粒体电子传递链活性会增强。
二甲双胍会减少血管内皮细胞VCAM-1的表达
内皮细胞功能紊乱与内皮组织VCAM-1的表达增强相关。VCAM-1是释放于血管腔表面的粘附分子,可诱导产生炎症网,并捕捉循环血细胞。子痫前期还与血循环中TNFa增多相关。TNFa是一种可上调VCAM-1的促炎细胞因子,为此进行了体外试验:将TNFa加入HUVECs中,显著上调了血管内皮细胞VCAM-1的表达。加入二甲双胍后,显著降低了TNFa引起的VCAM-1的表达,提示二甲双胍可以对于缓解内皮功能紊乱有影响。
二甲双胍缓解母体网膜血管的血管舒张状态
设计试验,模拟与诱发全血管功能紊乱相关的胎盘因子释放入母体循环的过程。将人网膜动脉分别孵育在胎盘条件培养基和普通培养基中。孵育于普通培养基中的血管加入缓激肽后100%扩增,而孵育于胎盘条件培养基中的血管,加入缓激肽后表现出40%的损伤。这说明试验中存在的胎盘因素可以损伤血管舒张功能。
向胎盘培养基的血管中加入二甲双胍,血管舒张功能的损坏得到了缓解。而对缓激肽相关的血管舒张功能的影响与普通培养基无差别。
二甲双胍可促进网膜血管组织芽生式血管生成
一般认为,血管生成功能减弱,可导致胎盘局部缺血、缺氧,引起子痫前期进一步发展。故探究二甲双胍缓解血管生成抑制的作用是否需通过sFlt-1达到。依照小鼠主动脉组织模型设计人网膜环组织血管生成试验。取剖宫产术中网膜活体组织标本,分离网膜血管,将其切分为小组织块,一半用sFlt-1孵育,一半不用。实验结果为:用sFlt-1孵育的网膜血管组织芽生式血管生成显著减少,但加入二甲双胍后,可缓解sFlt-1对血管组织芽生式血管生成的抑制。
评论
研究主要发现
二甲双胍可降低人原代组织sFlt-1和sENG的分泌,其机制可能是通过抑制线粒体电子传递链完成的。线粒体电子传递链可正向调控sFlt-1的分泌,其活性在子痫前期且早产的患者胎盘中增强。通过模拟子痫前期病程中可能存在的血管内皮功能紊乱状态的试验,发现了二甲双胍可有效缓解内皮功能紊乱,改善血管舒张功能,并促进血管生成。综上所述,提出:二甲双胍有预防及治疗子痫前期的潜力。
线粒体电子传递链可正向调控sFlt-1的分泌,二甲双胍可能能阻滞此通路
本文是第一篇报道线粒体电子传递链可正向调控sFlt-1的分泌。通过使用两种不同的阻滞剂,本文证明了阻滞复合体Ⅰ或Ⅲ均能显著减少sFlt-1的分泌。
本次试验同时间接证明了二甲双胍通过抑制线粒体电子传递链中复合体Ⅰ活性而而抑制sFlt-1和sENG的分泌。加入琥珀酸盐后可恢复又二甲双胍引起的sFlt-1分泌减少,若仅加入琥珀酸盐而无二甲双胍则对sFlt-1的分泌无影响。但该试验的局限性在于,琥珀酸盐本身可直接作为HIF-1a的稳定剂,所以并不能作为直接证据证明抑制了线粒体复合物Ⅰ。而且,二甲双胍本身可作为一种细胞内靶向物,并可以激活腺苷酸活化蛋白激酶。可能有人会提出二甲双胍可能是通过抑制滋养细胞合体化而减少sFlt-1的分泌。但这种假设可能性很低,原因如下:1)二甲双胍对于血管内皮细胞的sFlt-1的分泌无相同的影响;2)从完整的胎盘绒毛组织中观察到了sFlt-1分泌的减少;3)原代绒毛膜细胞的sFlt-1mRNA降低,这说明二甲双胍直接影响了细胞的转录机制。但本文确实并未结论性地表明二甲双胍一定是通过它对线粒体的影响而减少了sFlt-1的分泌。
在子痫前期且早产患者的胎盘中线粒体电子传递链活性增强
研究发现在子痫前期且早产患者胎盘中,组成电子传递链的所有复合物活性均增强,其中增强最显著者为复合体Ⅱ。其他另有两篇报道专门研究线粒体电子传递链活性。其中的一篇报道与我们的结论一致,也发现了复合体Ⅱ活性的显著增强。而另一篇报道却得出线粒体电子传递链活性会降低的结论。这两篇报道只使用了12例胎盘标本,且其中10例都来自足月妊娠。本研究首创选用早产胎盘,且和前两篇报道相比利用了很大量的样本。
本研究数据表明:子痫前期胎盘中线粒体电子传递链活性增强,这会增加sFlt-1和sENG的分泌。
通过筛选各种线粒体电子传递链抑制剂,发现了线粒体可以调控sFlt-1和sENG的分泌,这可能带给了子痫前期一个新的治疗位点。
二甲双胍可修复血管内皮功能紊乱并缓解子痫前期的特殊血管舒张状态
VCAM-1是一种与血管内皮功能紊乱相关的在子痫前期时高表达的炎性蛋白。早前研究已经表明二甲双胍可以减少血管内皮细胞炎症基因的生成和表达、降低血清VCAM-1的浓度、并修复糖耐量异常。子痫前期状态下TNF-a的表达会增强,但二甲双胍可减少血管内皮细胞VCAM-1的表达。
已有研究发现二甲双胍可舒缓被胰岛素抵抗和糖尿病影响的鼠血管。也在胎盘条件培养基上做过进一步的研究,是否二甲双胍可同样舒缓母体血管。实际上,二甲双胍可提高血管对缓激肽的反应。我们认为,这项研究的方法可以被广泛地用来评估各种小的生物分子对于妊娠状态下血管舒张功能的影响。
二甲双胍促进血管生成
患子痫前期时,血管存在一种不平衡的反增生状态。为此设计出一种试验探究二甲双胍对母体血管血管生成的影响。此外,还可以做其他很多的血管生成试验。如单独使用血管内皮细胞做管生成试验,或是将纤维母细胞和鼠主动脉环联合培养后做管生成试验。但这些其他试验并不如本研究所选择的手段那样贴切的模拟子痫前期所造成的血管功能紊乱。因为需要测试人类血管,需要测试包括血管内皮细胞和平滑肌细胞在内的非同源组织的再生。研究中将内皮功能紊乱和sFlt-1紧密联系到了一起,因为sFlt-1是和子痫前期紧密联系的反增生因子。研究发现,sFlt-1阻滞人网膜血管增生,而二甲双胍可缓解这种阻滞。数据表明二甲双胍可促进母体血管增生。
二甲双胍具有预防和治疗子痫前期的潜力
二甲双胍可在孕期安全使用并以被用于治疗妊娠期糖尿病。然而,在一项对比二甲双胍和胰岛素对妊娠期糖尿病治疗效果的随机对照试验中,并未发现同时患有高血压或是子痫前期的孕妇,在使用二甲双胍后有显著的疗效。二甲双胍组有3.9%孕妇同时患有高血压,有5.5%孕妇同时患有子痫前期;胰岛素组有6.2%孕妇同时患有高血压,有7%孕妇同时患有子痫前期。另外一项评估二甲双胍降低肥胖妇女围产儿死亡率的随机对照试验中,也未明确提出二甲双胍同时对于子痫前期的影响。但这也许是因为剂量不够或患者服从性较低。一份包括两项随机控制指标的meta分析,评估了二甲双胍对于患有多囊卵巢综合征孕妇妊娠结局的影响,其中也并未表明使用二甲双胍后可降低子痫前期风险。
值得注意的是,在这些实验中,妊娠期高血压或子痫前期并不是主要观察指标。而本文针对二甲双胍是否可预防及治疗子痫前期选用了权威的临床观察指标。本文得出的结论,二甲双胍可降低胎盘sFlt-1和sENG的分泌并缓解内皮功能紊乱,可以相信二甲双胍能够缓解胎盘或母体血管的子痫前期状态。
结论
本实验选用原代人体组织进行前临床试验,发现在子痫前期且早产病人的胎盘中,线粒体电子传递链活性增强,且线粒体电子传递链调控绒毛细胞滋养层细胞和血管内皮细胞sFlt-1和sENG的分泌。二甲双胍可通过抑制线粒体复合物Ⅰ活性从而减少sFlt-1和sENG的分泌。同时,二甲双胍缓解了由子痫前期引起的血管内皮功能紊乱的一些主要症状,并促进血管生成。所以,二甲双胍也许可作为预防和治疗子痫前期新手段。
参考文献:Brownfoot FC, Hastie R, Hannan NJ, Cannon P,Tuohey L, Parry LJ, Senadheera S, Illanes SE, Kaitu'u-Lino TJ, Tong S. Metforminas a prevention and treatment for preeclampsia: effects on soluble fms-liketyrosine kinase 1 and soluble endoglin secretion and endothelial dysfunction. AmJ Obstet Gynecol. 2016 Mar;214(3):356.e1-356.e15. doi:10.1016/j.ajog.2015.12.019. Epub 2015 Dec 22.
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