植入前遗传学诊断(PGD)技术主要应用于面临妊娠遗传性疾病高风险胎儿的夫妇,包括所有的单基因遗传病、X连锁隐性遗传病、染色体平衡易位等,避免或降低其因妊娠异常胎儿须面临的终止妊娠风险。目前PGD相对于其他的诊断技术,仍缺乏统一的规范和标准。目前欧美更多的联邦、州和当地政府开始关注PGD,并对提供PGD检测的实验室实施认证。PGD因其费用昂贵、流程复杂、技术要求高,需要更严格的组织管理,包括适应证的严格控制。临床工作中,我们一方面需要PGD技术选择“正常”胚胎,同时还应考虑到过多的操作可能为胚胎带来的更多干扰、可能引起基因印迹改变,导致子代出生缺陷的发生,PGD后子代的长远影响目前尚缺乏大样本回顾性分析的报道,但遵循自然生育规律的这一原则还是不宜将PGD、植入前遗传学筛查(PGS)人群扩展到所有体外受精(IVF)患者。
1 PGD指征
PGD适用于符合孟德尔遗传定律的遗传性疾病患者和(或)携带者,为了避免产前诊断后须面临的选择性终止妊娠;平衡易位及其他染色体结构异常,为了降低自然流产风险,或改善妊娠结局,或降低产前诊断后需要终止妊娠的风险,这一指征包括因平衡易位导致的反复自然流产患者及特发性反复自然流产患者。尽管针对后者常规治疗的预后比较好,但有些夫妇不愿意经历自然流产的创伤、痛苦和可能的并发症,可通过PGD降低自然流产风险;人类白细胞抗原(HLA)配型,可利用脐血干细胞和(或)骨髓移植治疗前一胎的特殊疾病;不育患者,因PGD可显著降低三体综合征发生率,所以PGD国际协会(PGDIS,preimplantation genetic diagnosis international society)认为,无论患者年龄如何、获得胚胎数量如何,均可能通过PGD改善妊娠结果;PGD可显著降低体外受精(IVF)患者的自然流产风险,所以,对于期望降低自然流产风险的夫妇,PGD是一个有效的选择,而不需要考虑患者的年龄和获得的胚胎数;PGD可提高特定人群(35岁以上、可移植胚胎数超过6枚)的活胎分娩率。尽管有矛盾的研究结果,但PGDIS认为,优秀的PGD中心可以改善上述人群的活产率。
PGS被称为“低危PGD”,因诊断目的及期望值与PGD患者有所不同,所以无论从遗传咨询角度,抑或诊断方法、胚胎选择角度,还是有所区别。PGS的目的主要是期望改善IVF患者的妊娠结局,普遍认为高龄、反复着床失败、反复自然流产患者是PGS的适宜人群,部分观念认为男性因素不育也是PGS指征。但每项指征的具体指标尚缺乏统一意见。ESHRE PGD联盟的建议为:高龄(年龄>36岁,或各自中心自行确定);反复着床失败:移植的优质胚胎数≥3枚或总移植胚胎数≥10枚,或各自中心自行确定,着床失败的定义为胚胎移植后5周及以上未见孕囊;反复自然流产(自然流产≥3次,或各自中心自行确定)。
到目前为止,更多的随机对照试验数据不支持D3胚胎活检结合FISH的PGS技术可以改善妊娠结局,但尚需更多关于极体及囊胚活检结合全染色体分析的技术以评估PGS的有效性。因PGD、PGS增加的胚胎体外操作可能导致的潜在影响,生殖中心的组织管理程度可能会影响PGS的使用范围及对IVF妊娠结局的改善程度。
2 PGD实验室的管理
相对于传统的产前诊断和遗传学诊断来说,PGD具有其特殊性,因单细胞或几个细胞的微量DNA,导致其诊断结果的可靠性难以达到高度准确。为提高PGD结果准确性,一些主流的PGD协会中逐步形成了明确的规范、法律和一些志愿者网站。例如欧洲质量分子网络(European Quality Molecular Network)尝试着在欧洲范围内提高和标准化分子诊断技术。欧洲人类生殖与胚胎协会(ESHRE)PGD联盟也尝试建立PGD共识(ESHRE PGD Consortium Steering Committee,1999,2000,2002),美国生殖医学协会(ASRM)2008年公布了美国PGD委员会报告,PGDIS 2004年颁布了PGD指南,并于2008年进行了修正。
PGDIS推荐对PGD实验室技术人员进行专项培训,目前尚缺乏单细胞诊断的正规培训计划,生殖中心可通过对专业技术人员的专项培训,包括熟练掌握使用各种仪器、熟练掌握各项操作、数据收集与分析等方面进行培训。培训应有详细的记录。应确认操作人员具备相应的技能后方可进行临床操作。上述管理机构对PGD实验室提供了行业规章制度准则与建议。规章制度的实施是通过实验室及专业技术人员核发执照与证书、对实验室进行定期检查与检测而进行。
PGD过程的每一步遗传分析都需要严格的质量控制,包括以1年数据为依据的误诊率、以未移植胚胎复查后计算出的误诊率。
3 PGD实验室的质量控制
PGD实验室的内部质控包括所有的质控记录、质控手册、质控制度、遗传咨询、差错记录等相关管理,并定期组织监督与管理检查质控制度落实情况,不断提高PGD实验室的内部质控。内部质控的首要目的是维持实验室结果的稳定性。PGD实验室内进行的每一个技术环节都需要定期的数据统计与分析,以追踪每一名技术人员的业务水平与效率,严格记录PGD流程中的每一步操作,系统分析质量控制参数。质控参数包括以下内容:胚胎活检过程中细胞损伤的比例;未得到诊断结果的细胞比例;根据每个胚胎计算出的误诊率及根据每个妊娠周期计算出的误诊率;着床率、临床妊娠率、临床流产率、活产率、多胎率,包括单合子及双合子多胎;临床应用前需要进行的最小预实验次数;不同PGD操作步骤中操作人员的能力评估标准。PGD流程中标本的标记和确认是非常重要的环节,须双人审核。
质量保障体系的最高标准是外部认证,但目前国内外尚缺乏PGD实验室的质量认证标准。到目前为止世界范围内缺乏PGD实验室质量保障系统的统一标准。国外部分中心借鉴了企业管理和工业生产中的质量认证与质量保障体系的管理模式,但PGD是一项涉及多学科、质量控制要求高的临床操作,其结果很大程度上取决于操作者的经验。所以每个PGD实验室需要制定严格的质量保障体系。工业生产的ISO质量保障体系不能完全满足PGD实验室质控管理要求。ESHRE PGD联盟推荐PGD实验室按照ISO 15189或同等级别的标准,并按照建议参加所在国家的PGD资格认证。
4 HLA配型在PGD中的应用
HLA配型可用于选择与同胞HLA配型的胚胎可用于治疗同胞的血液系统恶性疾病,包括白血病、重症地中海贫血等。HLA配型可能在两种情况下使用,一种是单基因病携带者夫妇,如地中海贫血,PGD在选择“正常”胚胎的同时,需要选择HLA配型与前一患儿相符的胚胎,有学者总结了242对夫妇461个IVF周期的数据,显示约12%胚胎为“正常”且HLA相符的胚胎。另一类则不需要考虑遗传病的诊断,只需要HLA配型选择,有数据显示约17%的胚胎为HLA配型相符的胚胎,两类均低于根据遗传概率估算的预测发生率(分别为19%和25%)。最终60%的周期至少有1枚胚胎可供移植,移植周期的继续妊娠率为30%,出生90名健康婴儿,1例误诊(HLA不符)。44例患儿得到救助。Tur-Kaspa等2015年总结了PGD在HLA配型中的应用,提出以下建议:该技术仅限于须接受干细胞、骨髓捐赠的患儿没有找到合适配型的捐赠者时使用;需要接受干细胞、骨髓移植的患儿病情稳定,可以等待至少9~12个月,其中IVF-PGD需要至少2~3个月;患者为生育年龄妇女,或有近亲(姐妹)供卵者为生育年龄。作者建议,发现罹患需要接受干细胞、骨髓移植疾病的患儿后,家长应尽快获得HLA胚胎选择的信息,以便他们有充裕的时间做出选择和决定。
目前国内外都可能面临PGD、PGS更广泛的临床应用,甚至扩展到对子代面貌特征的选择,但作为临床应用技术,我们须重视PGD、PGS的应用范围及指征选择以及可能面临的社会、伦理问题。
5 囊性纤维瘤PGD指南中可借鉴的经验
囊性纤维瘤(CF)作为欧洲人中最常见的常染色体隐性遗传病,在欧洲人群中的发生率为1/4000。欧洲基因检测网(EuroGentest Network)组织了7个国家18名PGD及分子遗传学诊断专家在法国蒙彼利埃于2011年12月组织讨论了囊性纤维瘤的PGD指南[5]。虽然CF在中国人中并不常见,但这一共识的建立对于单基因遗传病的PGD有借鉴之处。共识提出对要求CF PGD的夫妇应PCR分析DNA,以验证最初的诊断并明确突变基因类型,确定双方均至少携带了一个突变基因,才具备CF PGD指征。共识提出了CF的诊断实验、携带者检测实验及产前诊断及PGD指征,明确生育过CF患儿或胎儿产前诊断为CF的夫妇、通过携带者检测实验证实夫妇双方均为携带者的夫妇、一方为CF患者且另一方为携带者的夫妇、夫妇一方为CBAVD且另一方为携带者的夫妇。共识总结了CF常见的13种标志物及各自位于CFTR基因的位置、杂合率。患者有权利知道选择胚胎的基因型,不同CF基因型的表型差异可能很大,一些CF杂合子的表现可能从轻度或良性的变异,其临床表现可能没有临床征象,到中度和或迟发型CF。一些常见或罕见的CFTR变异可能存在更大差异的表型。PGD后与患者的咨询应包括上述内容。为降低ADO发生率及误诊风险,CF PGD时扩增了CFTR基因内或邻近的几个微卫星位点,共识建议PGD诊断机构需要针对每对患者夫妇的基因型确定选择卫星标记物,建议在致病基因两侧至少选择2个1 Mb以内的全信息微卫星标记物同时扩增,可有效检测出ADO,降低误诊率。因存在较高的ADO率,所以在使用多重置换扩增(MDA,multiple displacement amplification)进行全基因组扩增时,建议在两个致病基因的两侧分别各选择1个,共4个全信息微卫星标记物同时扩增。而且,半信息或非信息标记物可用于检测可能存在的污染和(或)染色体异常。部分生殖中心在对单基因病诊断时,也分析了染色体整倍体,可能有助于改善总体PGD结果。共识强烈建议妊娠后需要结合产前诊断进一步验证PGD结果。
PGD、PGS的临床应用范围及对妊娠结局的改善作用与PGD实验室组织管理程度密切相关,PGD、PGS技术越成熟、越稳定,可能今后的应用范围就会越广泛,甚至有些国家和地区已经将PGS应用于所有的IVF治疗周期,无论年龄和获得胚胎数量,但同时我们应充分重视PGD、PGS的适应证、对胚胎可能的潜在影响及对子代可能的远期影响,以及社会伦理问题。
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