胚胎活检是植入前遗传学诊断(PGD)和植入前遗传学筛查(PGS)的一个重要步骤,它不仅要保证所获取的细胞能适用于遗传诊断的要求,而且还要尽可能地降低活检对胚胎发育的影响。近年来,PGD、PGS发展迅速,选择一个合适的时机、合适的方法进行胚胎活检也显得尤为重要。
1、活检时机
PGD、PGS是针对着床前的配子或胚胎进行遗传诊断,临床上通常采用卵母细胞的极体、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚的滋养层细胞做检测。
1.1 卵母细胞的极体活检 极体是卵母细胞在减数分裂过程中形成的副产品,无论是第一极体还是第二极体都不是胚胎发育所必需的,对胚胎发育影响较小。极体活检可以提供的遗传诊断时间相对较长,有利于胚胎在新鲜周期移植。但是,利用极体只能推测来自母亲的遗传信息。从胚胎发育的角度看,并不是每一枚卵母细胞都会发育至可利用胚胎。因此,如果进行极体PGD、PGS,会增加无效的工作以及诊断花费。
1.2 卵裂期胚胎的卵裂球活检 采用卵裂期胚胎的卵裂球进行单细胞遗传学分析,可以同时分析来自父母双方的遗传信息。世界首例PGD婴儿即采用的卵裂期胚胎活检,卵裂期胚胎活检曾经是PGD工作中最主要的取材方式;在胚胎发育至6~8个细胞时进行胚胎活检,这个时期胚胎的卵裂球是具有全能性的,因此活检1~2个卵裂球不会严重影响胚胎的发育潜能。但是,由于可供诊断的细胞有限(1~2个)而且卵裂期胚胎嵌合比例较高,目前卵裂球活检所占比例在逐渐下降。
1.3 囊胚的滋养层细胞活检 体外培养的胚胎通常会在第5、6天发育至囊胚,此时胚胎的细胞数目明显增多,可以达到100个以上。囊胚的滋养层细胞将来会发育成胎盘或胎膜,不参与形成胎儿部分。因此,活检囊胚的滋养层细胞,不仅能够最大程度地反映胚胎的遗传信息,而且也能够避免对胎儿部分的损伤。囊胚的滋养层活检可以获得的细胞数目增多,而且囊胚期胚胎染色体嵌合比例显著低于卵裂期胚胎,这些都提高了遗传诊断的准确性;近年来,越来越多的PGD、PGS周期采用了囊胚期活检技术。当然,囊胚的培养技术、玻璃化冻融技术越来越成熟以及激光仪器的发展也为囊胚活检的广泛应用提供了技术保障。
目前,体外培养的的胚胎大约有40%左右能发育至囊胚阶段。一方面,囊胚期活检可能会出现没有囊胚形成、无胚可检的情形;另一方面,囊胚期活检能够检测形态学质量好的胚胎,虽然减少了活检的胚胎数目,但是可以有效地提高单胚胎移植妊娠率。
另外,囊胚发育不同步,需要多次活检;囊胚活检提供给遗传学分析的时间较短,通常需要冻存胚胎。
2 活检方法
胚胎活检是PGD过程的一个重要步骤,活检的过程对胚胎而言是一项侵入性的操作,活检是否成功直接影响到PGD的最终诊断。
2.1透明带打孔
2.1.1 化学法 是利用Tyrode’s酸将卵母细胞或者胚胎的透明带消化形成孔洞。由于Tyrode’s酸可能对胚胎有损伤,因此目前很少采用。
2.1.2 机械法 利用活检针机械摩擦透明带,形成孔洞。机械方法打孔不存在化学物质对胚胎的负面影响,透明带形成的是活瓣,缺损小;但显微操作技术难度高,不易熟练掌握,操作时间过长,有时还会影响胚胎的细胞骨架。因此,机械法应用也不广泛。
2.1.3 激光法 利用激光消除透明带或切割胚胎。此方法操作简单,方便易掌握,不与胚胎直接接触,可以任意调节孔洞的大小。
2.2 细胞获取极体采用吸取法获取。
卵裂球可采用吸取法或挤压法。胚胎发育过程中卵裂球的致密化程度对囊胚形成及胚胎发育具有重要意义,但是会给活检操作带来一定困难。在无钙、镁离子条件下,卵裂球之间连接易于松散,简化了活检操作,缩短了活检时间。
囊胚期活检大多采用激光法进行。可以选择在第3天针对所有胚胎进行透明带打孔,囊胚形成后再利用激光切割滋养层细胞;也可以在囊胚形成后,先进行透明带打孔再进行滋养层细胞获取。
3 活检对胚胎发育的影响
PGD、PGS的最终目的是要有健康子代分娩。活检是一项侵入性操作,它对胚胎发育的影响越小,PGD、PGS才能获得满意的妊娠率。
极体虽然是卵母细胞的副产品,但是极体活检是否影响胚胎发育的研究结果并不一致。Hammoud等将250枚生卵体外成熟后,分为3组:对照组、激光打孔组、激光打孔+极体活检组,比较3组卵的死亡率、激活率、胚胎染色体情况等等。研究显示,激光打孔和第一极体活检并未对胚胎造成不良后果。然而,Levin等的研究结果显示,极体活检的D2和D3胚胎卵裂率、胚胎碎片、胚胎细胞数和胚胎质量等情况均比未活检的胚胎要差。因此,极体活检影响胚胎质量。
卵裂期胚胎活检曾经是几年前的胚胎活检主要方式。早期的观点认为,卵裂球具有全能性,卵裂期活检不影响胚胎发育潜能。第3天的胚胎活检1~2个卵裂球后仍然具有较高的囊胚形成率,尽管囊胚的总细胞数目会减少,但不影响囊胚的发育潜能。近年来,越来越多的证据表明,卵裂期活检对胚胎发育有负面影响。Kirkegaard等利用实时监控系统观察卵裂球活检后的胚胎发育,PGD胚胎的卵裂球期明显延长,这可能是因为胚胎融合期延长以及胚胎孵出的机制发生改变所引起的。
Scott等的研究则更有代表意义,所有病例均移植2枚胚胎:一枚是经过活检的胚胎,一枚未活检胚胎;妊娠后,通过DNA指纹验证妊娠胚胎的来源。在卵裂期活检这部分研究结果显示,卵裂球活检的的胚胎着床能力比未活检胚胎下降了39%;而在囊胚期活检的研究部分显示,滋养层细胞活检与未活检胚胎着床能力差别不大。
囊胚期活检已经成为目前PGD、PGS的主要活检方式,由于活检后的胚胎遗传诊断需要时间,因此活检后的胚胎大多需要冷冻保存,等待遗传诊断结果后再解冻周期移植。
4 活检对子代安全性的影响
活检除了对胚胎发育有可能存在影响以外,PGD、PGS的子代安全性一直受到人们的广泛关注。
动物实验表明,卵裂期胚胎活检的小鼠的出生体重增长明显快于对照组,胚胎活检小鼠的神经退行性疾病发生的风险要高于对照组。人类的研究大多集中在新生儿或婴幼儿时期。有学者针对109名极体活检的新生儿进行随访,随访内容包括孕周、出生体重身长、出生缺陷等等;研究结果提示,极体活检对子代生长发育没有明显影响。Desmyttere等对102名卵裂球活检PGD、PGS子代随访了2年,结果显示,PGD、PGS子代在产前与产后2年内生长发育指标与卵泡浆内单精子显微注射(ICSI)子代无差异。Seggers等针对49个PGS子代和64个对照组儿童随访至4岁,分别测量血压、肱三头肌皮下脂肪厚度、肩胛骨皮下脂肪厚度等生长发育指标。PGS儿与对照组儿童在血压和一些身体发育指标差异无统计学意义,但是PGS儿接受一些辅助医疗护理(例如语言训练、身体训练等等)的比例高于对照组儿童。
PGD、PGS的临床应用仅仅有20余年,对于子代长期的安全性,我们仍然要持续关注。
5 活检细胞对遗传诊断准确性的影响
极低样本量对遗传诊断技术要求较高,对诊断的准确性以及有效性也存在影响。
5.1 极体 极体活检能够获得的细胞数目是1个,而且是单倍体,诊断的准确性相对较低;可以联合检测第一、二极体提高诊断的准确性。极体只能够推断来自母方的遗传信息,不能检测来自于父方或受精后发生的异常。
第一极体在排出后的数小时之内处于分裂中期,利用全染色体涂抹探针进行荧光原位杂交,可以判断处于分裂中期的染色体的结构。因此,可以通过极体活检区分正常和平衡的卵子。
5.2 卵裂球 卵裂期胚胎活检可以获取1~2个卵裂球,活检2个卵裂球虽然能够提高诊断准确率;但是影响胚胎发育。
卵裂期的胚胎可以同时反映父源及母源的遗传信息。但是,卵裂期胚胎嵌合比例高达50%以上,有可能造成误诊;因此,目前已经不主张在卵裂期进行PGS。
5.3 滋养层细胞 囊胚期活检可以获得数个或十数个滋养层细胞,大大提高了PGD、PGS遗传诊断的准确性。单细胞PCR 技术存在扩增失败、等位基因脱扣等风险,由于囊胚期活检的细胞数目增多,这些风险已经显著降低。目前,大多数学者都主张在囊胚期进行胚胎活检。
虽然囊胚期染色体嵌合的比例已经显著低于卵裂期胚胎,但是仍然存在一定比例,同时我们也不能完全忽视滋养层细胞与内细胞团细胞遗传学不一致的可能性。
综上,活检技术是一把双刃剑,它能够提供材料来检测卵子或胚胎的遗传信息,但是,它对于配子、胚胎是有创的操作。因此,我们在应用PGD、PGS时,应该把握指征、权衡利弊,同时也要选取合适的时机采取合适的方式进行胚胎活检,这样才能更好地发挥PGD、PGS技术的作用。
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