单核苷酸多态性芯片技术在染色体易位植入前遗传学诊断中的应用

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        染色体因素是导致不孕不育的重要因素之一。染色体异常可以导致在减数分裂配子形成过程中形成异常的配子，导致不良孕产史的发生或生育有先天智力发育迟缓或畸形的患儿。正常人群染色体异常发生率为0.37%~1.86%。在不孕人群中的发生率则为正常人群发生率的2~3倍。我们的数据显示，在中国华中地区不孕症夫妇中染色体异常的发病率为3.81%，是正常人群中的3倍左右。植入前遗传学诊断（PGD）是在体外受精过程中，对具有遗传病风险夫妇的卵裂期胚胎或囊胚进行细胞活检和遗传学诊断，以选择正常的胚胎移植，从而获得健康后代的方法，是辅助生殖技术的一个重要组成部分。因此，对于染色体易位携带者不孕不育夫妇一般建议通过PGD降低流产风险，获得正常后代。

        PGD主要过程是通过体外受精（IVF）、卵泡浆内单精子显微注射（ICSI）获 得胚胎、胚胎活检、遗传学检测及正常胚胎移植等。由于聚合酶链反应（PCR）和荧光原位杂交（FISH）技术的临床应用的局限性，近年来单细胞诊断的方法在不断地改善，逐渐发展了新的诊断方法，如比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH）技术、单核苷酸多态性微阵列（single nucleotide polymorphism array，SNP array）技术及二代测序技术（next-generation sequencing，NGS）等。本文重点围绕SNP array原理、SNP array进行PGD国内外现状、适应证、优缺点及展望等问题进行了讨论。

        单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是指基因组DNA序列同一位置上的单个核苷酸存在差异。一般而言，这种变异频率＞1%的单核苷酸变异即为SNP。在人类基因组中大概每1000个碱基就有1个SNP，人类基因组上的SNP总量大约为3×106个。这些SNP有的可能与疾病相关，但大多数可能与疾病无关。微阵列（microarray）是指固定在固体基片上的按特定的排列方式的大量探针DNA序列的基因芯片。这些探针DNA由微阵列器（arrayer）或机器人点样于尼龙膜或硅晶片上，制备成基因芯片，其原理仍然是核酸杂交理论，检测的样本DNA与DNA微阵列进行杂交、延伸反应，随后将芯片上未互补结合反应的片段洗去，再对基因芯片进行激光共聚焦扫描，通过一定的数据处理分析软件，可以将不同的荧光信号强度转化成不同基因的丰度，最后推算出待测样品中各种基因的信息。SNP array是应用已知的核苷酸序列作为探针与待测DNA序列进行杂交，通过对信号的检测进行定性与定量分析。因此，相比较于传统的单细胞诊断方法，SNP array技术属于高通量的检查方法，具有更多的优点。

        2011年Alfarawati等成功将微阵列比较基因组杂交（array CGH）技术应用于PGD并妊娠成功。2011年Treff等报道了SNP技术应用于PGD。2011年我们中心在国内率先将这项技术应用于PGD并获妊娠成功。目前在发达国家，基因芯片等高通量的检测技术都已经逐渐替代了传统的单细胞诊断技术如PCR和FISH。但在国内能进行高通量的检测技术进行PGD的中心不多，但是将来的趋势仍然是高通量的检测技术的应用。

        对于SNP array技术进行PGD的适应证主要有：染色体异常基因携带者；习惯性流产或不明原因流产的患者；生育过染色体异常患儿的夫妇；胚胎反复种植失败的夫妇。另外还有高龄女性（＞35岁），男性因素如重度少弱精子症等。已经有证据显示，囊胚期活检进行全染色体分析的PGD可以提高胚胎种植率和临床妊娠率。因此，这些夫妇在进行辅助生殖技术时可以通过SNP-PGD技术进行植入前遗传学筛查（PGS）选择正常、发育潜能高的胚胎移植以改善临床结局。

        与传统FISH相比，SNP array技术主要优点是同时并且更准确地检测23对染色体数目或结构异常且分辨率高。FISH技术最多只能诊断10~12条染色体，同时需要针对特定的染色体异常而选择特定的探针，因此对于部分染色体易位携带者，如果没有相应的商业化探针则无法进行FISH-PGD。另外单细胞固定技术要求高，如果细胞固定不良则易导致信号丢失、分裂等从而导致误诊。FISH技术的分辨率较低，只能达到～5 Mb，而CGH技术对检测缺失的敏感度高于对扩增的敏感度，对缺失的分辨率在2 Mb左右，对扩增的分辨率在10～12 Mb左右，array CGH技术则可对1 Mb的异常进行诊断。SNP 微阵列的分辨率高达1.5 kb，远高于及传统的检测方法，能发现以上几种方法漏检的微小片段的非平衡染色体易位、重复和缺失等。SNP array诊断快，SNP-PGD的实验流程共需要30 h，如果卵裂期活检则不影响新鲜囊胚移植。但目前仍然倾向于囊胚期活检进行SNP-PGD。

        SNP array分析的其他优点有可以追溯种植胚胎或者异常胚胎额外染色体来源和检测单亲二倍体（uniparental disomy，UPD）、三倍体等。通过SNP array结合父母基因型信息，可以追溯到染色体的来源及非重组染色体及重组染色体的类型，从而追溯非整倍体胚胎中多余的染色体来源于父方还是母方，通过对种植胚胎的资料数据进行回顾性分析及比较，可以为以后的移植胚胎选择及临床方案的调整提供指导。SNP array可以检测UPD和基因拷贝数变异。UPD是指同源染色体均来自同一个亲本，某些特定染色体定位的UPD可以引起智力障碍、发育迟缓，甚至可以导致胚胎死亡，传统的FISH和CGH技术都无法诊断UPD。因为SNP array技术的分辨率高达1.5 kb，较传统的CGH相比，可以发现低拷贝的拷贝数变异（copy number variation，CNV）。

        SNP 微阵列缺点主要有无法区分完全正常及染色体平衡易位或倒位携带胚胎，诊断仍存在2％~4％的误诊率（胚胎嵌合）。另外检测需要昂贵的设备、耗材，增加了患者经济负担。另外是单细胞DNA扩增。胚胎活检后的单细胞DNA量（5~6 pg）无法满足进行微阵列分析最少DNA量（200 ng）要求，因此活检后细胞需先进行全基因组扩增才能得到上述DNA产量。而全基因组扩增的DNA产物其保真度并非100％，这些都可能会影响到微阵列诊断分析的准确性。虽然目前尚未见SNP array进行PGD的误诊率的相关报道，但是SNP arrayPGD误诊的风险仍然值得我们关注。

        SNP array PGD目前主要应用于染色体易位、倒位、数目异常、PGS及单基因病等。近年来，越来越多的文献报道了采用SNP基因芯片进行单基因病PGD。Handyside等采用karyomapping（核型定位）的方法首次将SNP基因芯片应用于单基因病PGD。karyomapping的原理是通过连锁分析，利用SNP的遗传标记确定携带缺陷基因的染色体。利用这些标记可看到致病的基因所在的染色体片段，并确定这个片段是遗传自父亲还是母亲，从而对胚胎进行诊断以选择不发病的胚胎进行移植。Natesan等将karyomapping方法在25中单基因病PGD中进行了验证，结果显示与单体型分析比较诊断一致率为97.7%。因此采用SNP基因芯片的karyomapping方法是单基因病PGD通用方法。另外，除PGD外，SNP基因芯片也可用于其他细胞、组织的检查如流产组织、羊水细胞等，也用于有不良孕产史但G显带染色体核型正常又无其他病因的夫妇及不明原因发育迟缓、智力发育障碍的新生儿或幼儿等进行分子核型筛查等。

        综上所述，SNP array技术为有遗传病夫妇提供了生育正常后代的有效方法，是优生优育的重要手段之一。但是其在临床应用过程中的缺点仍然不能忽视。同时在我国，关于SNP arrayPGD仍然缺乏统一的芯片检测分析标准、报告解读指导性文件及相关监督管理行业协会标准等。各个检测中心技术水平参差不齐，地区发展不平衡等也制约了SNP array技术的开展。但随着相关的行业标准的制定，技术不断发展完善以及检测成本逐渐降低，SNP array将有更广阔的应用空间。