人类辅助生殖技术(assisted reproduetive techniques,ART),包括人工授精(arrificial insemination,AI),体外受精与胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)及其衍生技术。人工授精是收集丈夫或自愿者的精液,由医师注入女性生殖道以达到受孕目的的一种助孕方法。体外受精与胚胎移植是将精子和卵子取出体外,在特定的实验室条件下进行人工受精和早期胚胎发育的培养,继而选择质量良好的早期胚胎移植回人体子宫内,并使其继续生长至分娩的复杂技术。
人 工 授 精
一、人工授精分类
(一)、根据所用精液不同的来源,可将人工授精分为三类:
1.夫精人工授精:用丈夫精液进行的人工授精夫精人工授精(artificial insemination with husband semen,AIH)。
2.供精人工授精:用他人的精液进行的人工授精称他精人工授或供精人工授精(artificial insemination with donor semen,AID)。
3.混精人工授精:
(二)、根据人工授精贮存时间的长短可分为二类:
1.鲜精人工授精(artificial insemination with fresh semen), 是指精液离体后尽快进行处理并行人工授精。优点是较简便,成功率较高,缺点是有传染疾病的可能。主要用于夫精人工授精。
2.冻精人工授精(artificial insemination with frozen semen),是指精液离体后采用一种特殊的办法进行超低温冷冻保存(一般保存在-170℃液氮罐中),当需要时将冷冻精液复温后行人工授精。成功率较低,需要较复杂的仪器设备。优点是按全。
(三)、 按授精部位的不同,分为6种:
1.阴道内人工授精(intravaginal insemination,IVI)
2. 宫颈内人工授精(intracervical insemination,ICI)
3.宫腔内人工受精(Intrauterine insemination, IUI)
4.腹腔内人工授精(direct intraperitoneal insemination,DIPI)
5.卵泡内人工授精(direct intrafollicle insemination,DIFI)
6.经阴道输卵内人工授精(transvaginal intratubal insemination,TITI)
二、 人工授精适应证
(一)夫精人工授精适应证
1.精液正常但性交困难和精液不能射入阴道者,需要人工将精液注入女性生殖道中才能孕。如某些畸形体形使性交不能;尿道上、下裂;不射精症;严重早泄、阳萎、逆行射精症;女性性交阴道痉挛;阴道解剖结构异常、子宫脱垂等。这类患者的治疗较容易,只需收集丈夫的精液,在其妻子排卵期,注入生殖道内即可。
2. 精液质量异常者,比如少、弱、畸形精子症,精子存活率低、活动度低,精液不液化症等。
3 精子在女性生殖道中运行障碍者:可由功能性、器质性和免疫性等原因引起。比如子宫位置异常(如严重的后倾、后屈),宫颈因素不佳(比如宫颈狭窄、粘连、宫颈粘液少而粘稠等)。
4 免疫性不孕:夫妇一方或双方抗精子抗体阳性,性交后试验(PCT)不佳。
5 不明原因性不孕症:所有不明原因实际上是有原因的,只是目前的医学科技水平还无法查到其确切的原因。
上述2、3、4、5项行人工授精时,其精液尚需进行一系列实验室处理,比如精子的洗涤、上游、下游、过滤、密度梯度离心分离等方法,其中至少需经洗涤处理。
(二)供精人工授精适应证
1.肯定男方无生育能力,如完全的无精症、死精子症。
2.不能治愈的少、弱、畸形精子不育症。
3.男方携带不良遗传基因,如精神并癫痫、严重的家族性遗传病如黑蒙性痴呆等。
4.夫妻间特殊的血型不相容性,如严重的Rh血型不和。
5.输精管阻塞、输精管结扎术后无法再复通者。
6.其他类别的不孕症,比如难以治愈之严重的精液不液化症、免疫性不孕症、以及不明原因不孕症等。
三、 精液处理
(一)、精液处理的目的
1.达到合符要求的活动精子密度;
2.减少或去除精浆内前列腺素、免疫活性细胞、抗精子抗体、细菌与碎片;
3.减少精液的粘稠性;
4.促进精子获能,改善精子受精能力。
(二)、精液标本收集
(三)、精液处理方法
1.二次洗精法:
2.上游法:
3.Percoll非连续梯度分离法:
四、 人工授精的时机
人工授精一般在排卵前进行,让精子等卵子,因为精子在女性生殖道内存活时间长,而卵子排出后仅存活24小时左右。主要根据宫颈粘液评分、激素测定预和卵泡监测综合判断排卵时间。
(一)宫颈粘液平分:
(二)、素测定预测排卵:
在估计排卵日的前2-3天开始,使用血清或尿标本测定LH,行宫颈内人工授精则应在LH峰出现当天进行,而行宫腔内人工授精可以稍后1至2天,若注射HCG控制排卵时间,则应在注HCG后36-42小时进行,此刻正是卵子从卵泡释出的时间。
(三)、B超监测卵泡发育和子宫内膜厚度:
卵泡的大小应以长、横二径平均值来估计,近排卵日卵泡每日可生长2.2-3.0mm,卵泡≥18 mm表明卵泡已成熟,即将排卵。排卵后的B超显示卵泡变小或萎陷、子宫直肠窝有液性暗区,子宫内膜的厚度>10mm表示已完全雌素化。
五、人工授精的方法
(一)、阴道内人工授精(intravaginal insemination,IVI):
(二)、宫颈内人工授精(intracervical insemination,ICI):
(三)宫腔内人工受精(Intrauterine insemiation,IUI):
(四)腹腔内人工授精(direct intraperitoneal insemination,DIPI):
(五)直接卵泡内授精(direct intrafollicle insemination,DIFI):
(六)经阴道输卵内授精(transvajinal intratubal insemination,TITI):
现在有多种方法应用于临床,比如①阴道超声引导下行输卵管插管法;②腹腔镜监测下行输卵管插管;③徒手操作凭经验、凭感觉行输卵管插管;④输卵管灌注法,即利用宫腔压力使输卵管内口张开,将精子悬液注入至子宫、输卵管中。TITI较适合输卵管一侧正常而对侧有解剖或功能改变、卵巢对刺激反应低下、宫颈因素、子宫内膜异位症、男性因素不孕、不明原因不孕症等。
六、人工授精的妊娠率
由于各地研究方法不同,如病人选择、诊断标准、精液处理、授精时间、统计方法的异别存在,因此是难以比较。对于精子质量较好性交时精液未能接触宫颈的AIH,妊娠率可高达80%以上,而精子质量差或因宫颈困素行AIH者妊娠率偏低,精液处理后IUI的比不处理精液ICI高,若存在宫颈因素ICI则妊娠率更低。采用新鲜精液人工授精比冷冻精液的妊娠率高,但存在感染某些疾病的危险性,目前认为供精者人工授精以用冷冻精子为宜,新鲜精液人工授精妊娠率一般为20%左右,而冷冻精液IUI亦较ICI妊娠率高。人工授精结合超排卵周期,精液处理以及授精技术改善,其妊娠率会不断提高。
七、人工授精实验室基本设备
从事人工授精工作的单位至少应具备采精室、授精室、精液准备室。
主要设备如下:
CO2孵箱
恒温水浴箱1台
普通光学显微镜1台
离心机1台
精子计数(分析)仪1台
妇科检查(治疗)床1 张
超净操作台1台
消耗器材、物品:窥阴器、宫颈抓钳、卵圆钳、镊子、剪刀、穿刺针、治疗巾、手术衣、精子洗涤(培养)液、无菌纱布、无菌棉球、75%乙醇棉球、授精导管、离心管、普通试管、试管架、玻片、移液管、吸管、计数板、注射器等。同时备细胞用一些抢救药品
体外受精及胚胎移植技术
一、IVF—ET的适应证与患者准备
(一)、适应证:
1.一般要求年龄≤40岁,大于40者也可以做,但成功率很底;
2.输卵管不通或通而不畅,如各种原因造成的输卵管缺损、梗阻及病变等;
3. 盆腔与腹膜因素,如手术或炎症引起的盆腔粘连;
4. 子宫内膜异位症,对有较大巧克力囊肿者宜先穿刺抽吸囊肿;
5. 排卵障碍:如内分泌因素或机械性因素造成的LUFs、多囊卵巢综合征等;
6. 免疫因素:如抗精子抗体阳性者;
7. 精液异常,如少精症、弱精症、无精症(但睾丸活检有精子,即阻塞性无精症);
8. 不明原因性不孕经其他方法治疗后无效者;
(二)、患者准备:
1. 病史和体格检查:了解病史及月经周期,进行妇科检查,尤其注意了解既往妊娠情况及其结局及不孕症的治疗过程。
2.辅助检查:
⑴.B超 :明确子宫形态和大孝内膜是否规则、卵巢的穿刺位置和排卵情况;
⑵.生殖内分泌常规测定:月经周期第2—3天抽血测卵胞刺激素(FSH),黄体生成素(LH),雌二醇(E2),孕酮(P),睾酮(T0)以及垂体泌乳素(PRL)。
⑶.子宫内膜病理检查:来月经前1天或来月经12小时内取子宫内膜病检,以排除内膜慢性炎症、结核等病变;
⑷.免疫学检查:如抗精子抗体、抗磷脂抗体;
⑸.宫颈及阴道细胞菌学检查;
⑹.术前一个周期探测宫腔;
⑺.精液常规检查:①量不少于2ml;②精子浓度≥40×109/L;③成活率≥50%,其中快速直线运动精子≥50%,或排精60分钟内,快速直线运动精子≥25%;④50%以上的精子形态正常;⑤白细胞数应少于10×108/L。必要时可做精液微生物学检查。
⑻.其他检查,如血常规、肝肾功化验、乙肝抗原、病毒10项、染色体等;
上述检查如有不正常应先进行治疗,纠正后再行IVF—ET。
3. 理准备:
让夫妇双方了解IVF—ET的大致过程、可能出现的结果,以增强信心,消除紧张情绪。并签署IVF—ET同意书。
二、人工控制下的超排卵及其监测
控制超排卵(controlled ovarian hyperstimulation, COH)又称控制下的卵巢过度刺激。自然周期只有仅单个优势卵泡发育成熟,只能获得一个卵子。通过药物刺激控制超排卵,同时诱导多个卵泡同步发育,在一个周期内一次取卵术可获得数个甚至数十个成熟卵子,经体外受精提供多个可用于移植的胚胎,从而提高了IVF—ET总的成功率。
(一) COH常用药物
1.枸橼酸氯酚胺(clomiphene citrate, CC)
2.尿促性腺激素(hMG):是目前COH中应用最多的药物。该药物提取自绝经期妇女的尿,含有FSH、LH各半量,可单独应用,也可与其他药物联合应用。hMG募集的卵泡数目一般比CC多,对大多数患者卵巢反性好,内源性LH峰产生的可能性较单应CC校但花费较CC大,形成卵巢过度刺激的可能性增加。
3.卵泡刺激素(FSH):hMG中所含的 LH对诱发超排卵不利。卵泡刺激素不含或仅含很少量的LH,对卵泡早期的募集很有作用。尤其对于LH/FSH比值过高、多囊卵巢并以往hMG治疗反应差、年龄较大等患者效果较好。但目前FSH只能靠进口,而且价格昂贵。
4.促性腺激素释放激素动剂(gonadotropin releasing hormone analogues, GnRHa):目前临床应用的GnRHa均为人工合成制剂,对GnRH受体有高度的亲合力,形成具有生物活性作用的激素受体复合物,刺激垂体促性腺激素的急剧释放。若GnRHa持续作用,垂体细胞表面可结合GnRHa受体减少,对进一步GnRHa刺激不敏感,使促性腺激素分泌处于低水平,即所谓降调节作用(down—regulation)。血激素测定等可提示这种去垂体状态:LH的体外受精过程,而且妊娠率也较高,可达25%—35%,甚至更高。缺点是不适用于输卵管性和盆腔粘连的不孕症,故在选择病人时,道先要考虑到输卵管的功能。
配子输管内移植COH、取卵术以及精液的体外处理与IVF—ET相同。配子移植或胚胎移植需在腹腔镜下进行,用18号弹力性外套的20cm的针头,将精子和1—3个卵子或受精卵注入每侧输卵管的壶腹部。
经阴道逆行性GIFT:是对腹腔镜下GIFT技术的一个改进。采用阴道B超引导经阴道穿刺取卵术,再用特制的导管行经阴道、宫腔、输卵管逆行插管,将配子直接经该导管注入到输卵管内。这种逆行性配子移植术,不仅创伤小,而且增加了GIFT的技术灵活性,如卵子可经适当成熟培养后再移植;如有OHSS倾向,可在下一个自然周期再行配子移植;卵子还可经体外受精后,实施逆行性GIFT。该技术的缺点是技术难度大,寻找输卵管口逆行插管,需熟练的技术技巧,否则易造成损伤,影响成功率。
三、卵子及胚胎赠送
卵子赠送适应证:①无卵巢或卵巢无功能者:卵巢切除,卵巢早衰或化疗、放疗后的卵巢功能衰竭,先天性卵巢发育不全,卵巢抵抗综合征;②卵巢有功能者:遗传性疾病携带者或患者,反复IVF或其他助孕技术失败者。无卵巢或卵巢无功能的受者,在接受供卵或供胚前必需进行类固醇激素替代治疗,目的是促进子宫和子宫内膜发育并产生周期性变化,诱导内膜雌、孕激素受体产生,诱导内源性LH峰发生。一般采用戊酸雌二醇与黄体酮联合应用。在替代治疗中要注意监测血清激素变化及子宫内膜的反应,注意要调整供者与受者月经周期的同步性。对卵巢有功能受者,供卵或供胚的移植可在自然周期进行。
四、人类胚胎及卵子库
在包括IVF—ET在内的多种助孕技术中,由于超促排卵技术的实施,一次可取到多个卵子,往往造成卵、胚胎过剩。如一次移植数目过多,则造成多胎妊娠率上升。解决此问题的最好办法是将这些多余的卵子或胚胎冷冻保存(在-196℃条件下),即可用于患者非刺激周期即自然周期配子或胚胎移植用,也可为某些疾病的患者(卵巢功能早衰、遗传病携带者等)进行异体IVF—ET提供方便,并可解决供体和配体间不同步问题。此外,卵子与胚胎库也可作为人类生育力的一种储备形式,有利于计划生育,解决某些后顾之忧。
五、卵细胞浆内单精子注射(ICSI)
俗称第二代试管婴儿。主要用于严重的少精症或无精症(睾丸活检有精子或生精细胞)及常规体外受精失败的病例。近年的研究发现,少精症及无精症与Y染色体长臂微缺失有关,所以卵细胞浆内单精子注射易将患病的基因传给其儿子,就是说卵细胞浆内单精子注射所生的男婴中,今后患少精症或无精症的可能性比较大。因此,必须严格掌握指征,术前做必要的遗传学检查和咨询。
六、植入前遗传学诊断(PGD)
俗称第三代试管婴儿。取出一个卵裂球或极体,进行遗传学检查,以诊断染色体病和基因病,如血友病,地中海贫血等。目前,植入前遗传学诊断能对30多种遗传病做出诊断。
七、卵胞浆植换术
俗称第四代试管婴儿。年龄对女性的生殖能力影响很大,随着年龄的增长,女性的生殖能力逐渐降低,卵胞质量衰退,表现为受精、卵裂、着床等能力下降。卵胞浆对卵子的质量有重要影响,用年轻妇女所提供的卵胞浆植换反复体外受精失败者的卵胞浆能达到改善卵子质量的目的,从而提高反映不良患者,尤其是高龄妇女的胚胎活力和试管婴儿的成功率。
卵胞浆植换的机理:研究发现,卵子的老化主要改变是卵胞浆中腺粒体减少。腺粒体是产生ATP的细胞器,为细胞代谢提供能量。腺粒体减少,ATP产生不足,影响细胞的各种生理活动,表现为受精能力底下等。将健康卵子的胞浆移植到老化的卵子内,弥补后者的腺粒体的缺乏,使其恢复了正常的生理功能,提高受精率、植入率,从而提高了试管婴儿的成功率。
可以看出,所谓第一、二、三、四代试管婴儿,只是适应症不同,相互不能代替,而不是一带更比一带好。
八、囊胚培养及移植
卵子对体外培养的环境及培养基要求很高,通常的试管婴儿卵子在体外只培养2—3天、受精卵分裂到2—8个卵裂球阶段即进行移植。在此时期进行移植的主要不足是,与正常生理情况相比胚胎过早地进入宫腔。生理状态下,受精卵在输卵管内发育到囊胚阶段(排卵后5—6)才进入宫腔,与子宫内膜结合着床的。当胚胎过早地被移植后,由于胚胎的发育与子宫内摸不同步,胚胎需要在腔内继续发育几天才开始着床,而此时的宫腔内环境并不适合早期胚胎的发育。囊胚移植与常规情况相比,更符合生理情况,通过延长体外培养的时间,可自然淘汰无发育潜能的胚胎。近年由于培养基的发展,使在体外培养至囊胚阶段成为可能。但目前囊胚培养技术尚不完全成熟,能发育到囊胚阶段的胚胎比率不高,所以囊胚培养和移植仅限于卵子培养第3天观察优质胚胎较多的病例。囊胚移植单卵双胎的发生率提高,另外男婴偏多。
九、辅助孵化
卵子及早期胚胎的外面包裹着透明带,它是一层糖蛋白,其功能主要有:受精时促进精卵结合并防止多精受精;在早期胚胎阶段,防止尚未紧密结合的卵裂球分散丢失;在着床前,保护胚胎免受细菌及免疫细胞的侵害。当胚胎进入宫腔后,由于囊胚的扩张及其分泌的溶解素的共同作用,囊胚由透明带中孵出后,才能植入。某些情况下囊胚孵出障碍,着床失败。这也是试管婴儿成功率不高的一个可能原因。辅助孵化,即利用物理或化学的方法,人工地在胚胎的透明带上制造一处缺损或裂隙,从而有利于胚胎从透明带内孵出,增加着床的可能性,提高妊娠率。主要方法有酸化法、酶消化法、机械法和激光法,其中激光法安全、简便、快捷。辅助孵化主要适用于体外受精失败史、透明带厚度大于15微米、胚胎质量差、透明带形态不规则、年龄大于35岁妇女及冷冻胚胎等。
十、未成熟卵体外培养
从手术卵巢切除标本、胎儿卵巢等找到不成熟卵,在体外培养成熟,成为某些特殊情况下的卵子来源,如卵巢早衰等。有个别成功的病例报道,技术尚不成熟。
十一、多胎妊娠减胎术
辅助生殖技术中,多胎妊娠率达30%左右。减胎术即能达到生育目的,又能减低多胎妊娠的风险和不良预后。一般在孕7—10周进行,妊娠中期也可以进行。途径有经阴道和腹部两种。方法:机械性毁损;注射药物(氯化钾、高渗盐水等)。并发症:流产率10-20%;感染;母体凝血功能障碍;
十二、重组促卵泡激素的应用
以往超促排卵主要用尿促性素(hMG), 尿促性素是由绝经期妇女的尿液中提取的,含有FSH 和LH各75单位。超促排卵主要需要FSH,而高水平的LH反会影响卵子质量,降低卵子的受精率和植入率。另外尿促性素95%属外源蛋白,故偶有过敏反映。重组促卵泡激素是利用基因重组技术,将人FSH亚单位的基因,转染到中国金毛黄地鼠卵细胞系产生的,商品名叫果纳芬。与尿促性素比较,重组促卵泡激素具有下列优点:不含LH和尿蛋白;纯度达99%;有较好的卵母细胞成熟度;获得的优质胚胎多;较高的受精率和妊娠率;卵巢过度刺激综合症发生率降低(小于1。7%);无过敏反应。
促性腺激素释放激素拮抗剂的应用
十三、冷冻保存技术在辅助生殖技术中的应用
辅助生殖技术中的冷冻保存技术主要涉及精子胚胎及卵子的冷冻保存。它有以下的实用意义:①精子库或卵子库的建立,为精子及卵子的赠送提供极大的方便;②生殖保险的功能,如放疗、化疗前精子或卵子的保存;③试管婴儿中期,移植后如有剩余胚胎,可冷冻保存,以备万一失败,今后再移植。其优点是经济,少痛苦;④当治疗周期发生卵巢过度刺激综合症等并发症事,暂不移植,将胚胎冷冻保存。目前精子及胚胎的冷冻技术比较成熟,而卵子的冷冻技术尚不成熟。以前对胚胎冷冻,多推崇利用程序冷冻仪控制降温的程度和速率,对胚胎进行缓慢的降温。近2年,认为玻璃化胚胎快速冷冻法优点更多。玻璃化快速冷冻法不需要机密的程序冷冻仪,室温下即可进行,操作简单,对细胞损伤小.
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