辅助生殖技术(assisted reproductive techniques, ART)是指通过对卵子、精子、受精卵、胚胎的操作处理,最终达到治疗不育(孕)的系列技术。
分为人工授精(artificial insemination)、体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)及衍生技术两大类。
1、人工授精,分为丈夫精液人工授精(AIH)和供精人工授精(AID)两大类,前者采用丈夫的精子,后者采用供精者精子。
2、体外受精-胚胎移植及其衍生技术是指使精子、卵子在体外相遇受精,再移入母体达到妊娠的辅助生育技术。主要包括常规IVF-ET、配子/合子输卵管内或宫腔内移植、卵胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injectioin, ICSI)、胚胎种植前的遗传学诊断(pre-implantation genetic diagnosis, PGD)、胚胎冷冻、卵子与胚胎赠送、代孕等。
人类辅助生殖技术的历史最早可追溯到200多年前,1790年,John Hunter 应用人工授精方法,为一对患有尿道下列的不孕夫妇解决了生育问题。1978年,由妇产科专家Patrik Steptone和胚胎学家Robet Edwards联合应用体外受精-胚胎移植技术,获得首例试管婴儿的诞生,即第一代试管婴儿。1992年,Palermo使用ICSI技术获得成功,即第二代试管婴儿。PGD则为第三代试管婴儿
未成熟卵细胞体外成熟技术(IVM) 概念:随着第一、二、三代试管婴儿技术的出现,为部分不孕患者解除了不能生育的痛苦。但一些因顽固性多囊卵巢综合征、卵巢过度刺激等导致卵子不能在卵巢正常发育成熟的患者仍然不能受孕。可采用 IVM技术对这些因卵子成熟障碍而不孕的患者进行治疗,即将卵巢中的未成熟卵取出,采用特殊的培养液模拟体内的卵泡微环境,将卵子在体外培养,待其成熟后,进行显微授精,等授精卵发育成熟,再植入母体子宫腔内。1994年,采用IVM技术获得了首例妊娠成功。
未成熟卵细胞的来源:1、排卵正常妇女自然周期第7-12天,从直径为4-12mm的卵泡中吸取;2、多囊卵巢患者自然周期第5-12天,从直径为2-10mm的卵泡中吸取;3、超排卵周期,因可能发生卵巢过度刺激,而未用hCG者;4、ICSI过程中,准备丢弃的未成熟卵细胞。
目前能开展该技术生殖中心不多,国内已经成功的有江苏省人民医院生殖中心等。该技术的成功应用,能有效地治疗因卵子成熟障碍而造成的不孕,还为人类卵子发生发育机制的基础研究提供了重要的理论依据;为腔前卵泡的成熟、保存、利用提供了技术基础;解决了卵母细胞保存困难的问题,有利于我国建立人类卵子库。
睾丸生精细胞的体外成熟
与卵细胞体外成熟一样,生精细胞的体外成熟则是解决男方无法获得成熟精子的有效方法,但其成功的报道很少。
精子发生是一个十分复杂的过程,可分为3个阶段:精原细胞有丝分裂阶段、精母细胞减数分裂阶段和精子细胞变形阶段;精子生成包括连续的有丝分裂、减数分裂和减数分裂后成熟过程。生精细胞体外成熟已成为治疗男性不育的一种方法。
培养方法:
1、组织(或器官)培养:取部分睾丸组织或曲细精管片段进行培养而不作任何的细胞分离处理,这是最早采用的培养方法,现在一般会将睾丸曲细精管进行简单的物理分离或酶消化处理,得到非常细小的小管碎片,且不过多破坏睾丸中生精细胞与各种睾丸体细胞之间固有的联系,然后进行培养。
2、细胞培养: 细胞培养是生精细胞培养的发展方向,但生精细胞单独培养仅能存活2~3d。因此一般采用生精细胞-Sertoli细胞共培养(coculture)的方法:首先分别分离睾丸生精细胞和Sertoli细胞,然后进行共培养,使这些细胞之间在培养过程重新建立联系。
3、培养系统:基础培养液一般采用DMEM/F12培养液,添加一些生长因子和激素(卵泡刺激素和睾酮);培养温度一般选择32~24℃,95%空气和5%CO2。
难点
目前的方法可使细线期精母细胞经减数分裂分化为精子细胞,但这只是整个精子发生过程的一部分,精原细胞还无法分化为初级精母细胞;精子细胞无法完全在体外成熟为精子。
临床应用
虽然生精细胞培养还没有取得令人满意的结果,但生精细胞的体外成熟技术已经应用于临床上。1999年,Tesarik等培养了5例睾丸精子发生停留于初级精母细胞阶段病人的睾丸生精细胞,结果2例最终得到了精子细胞,将其通过显微注射法注入其配偶的卵子,结果2例均受精成功,其中1例在36周后生育1对双胞胎,且发育正常。另外对1例不育患者的睾丸精子细胞在体外培养24小时,然后进行ICSI,结果使其妻子生育了1对双胞胎。